水稻OsVPE3转基因株系表型及其盐胁迫诱导的程序性细胞死亡研究

摘要

细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是一类由基因调控的、有序的细胞死亡现象，广泛存在于动植物中，对生物生长发育、抵抗各类生物及非生物胁迫具有重要作用。在植物中，已鉴定出一系列具有动物caspase样活性和相似结构的PCD调控蛋白，如液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）等。
　　液泡加工酶是一类具有caspase-1活性的半胱氨酸蛋白酶，为蛋白酶C13家族成员。VPE经自我切割产生成熟体后介导植物细胞程序性死亡，然而其具体的互作蛋白以及调控途径仍不清楚。前期研究表明，过表达抗凋亡基因Bcl-2水稻可抑制胁迫诱导的OsVPE2和OsVPE3转录并降低PCD发生，导致抗逆性增强。本研究通过对水稻OsVPE3过表达和干涉转基因株系的鉴定，运用实时定量分析、原生质体细胞膜及液泡染色和免疫共沉淀等技术，进一步探讨OsVPE3基因在盐胁迫诱导PCD通路中的作用机制。
　　取得实验结果如下:
　　1.OsVPE3表达对水稻种子表型的影响
　　通过qRT-PCR鉴定OsVPE3过表达和RNAi抑制转基因株系，并统计T3代转基因纯系种子长宽和千粒重，结果表明抑制OsVPE3表达将引起水稻种子宽度显著减小，千粒重下降。结合OsVPE3表达谱分析，推测OsVPE3可能通过切割贮存蛋白参与种子成熟过程。
　　2.盐胁迫下OsVPE3干涉株系抗盐性提高
　　通过3天高盐处理4周的水稻苗，结果显示OsVPE3干涉株系的存活率比野生型显著提高，且能够维持更多的叶绿素含量。该结果表明抑制OsVPE3的表达可以提高水稻盐胁迫下的抗逆性。
　　3.抑制OsVPE3表达可减弱PCD发生及提高耐盐性
　　高盐处理水稻幼苗3天后，通过对主根相对伸长量的测量统计，以及根尖伊文斯蓝染色发现:与野生型相比，OsVPE3干涉株系根相对伸长量显著增加，根细胞活力较强，死亡较少;而OsVPE3过表达株系与之相反，根相对伸长量减少，细胞活力较弱，死亡较多。DNA laddering检测显示，抑制OsVPE3表达可以明显减弱基因组DNA片段化，而OsVPE3过表达会增强基因组DNA片段化。表明抑制OsVPE3表达可减弱PCD发生，从而提高水稻幼苗耐盐性。
　　4.盐胁迫下OsVPE3介导水稻液泡破裂引起PCD
　　经BCECF-AM和Trypan Blue染色发现，盐处理后野生型原生质体的液泡膜破裂发生于细胞死亡之前，表明液泡的破裂是发生PCD的前奏。而抑制Os VPE表达可以显著增强液泡膜的稳定性，抑制液泡破裂，提高原生质体存活率。以上结果说明OsVPE3通过调控液泡破裂参与盐胁迫诱导的PCD发生。
　　5.OsVPE3表达对水稻叶片和气孔发育的影响
　　通过观察4周水稻的叶片，发现OsVPE3干涉株系的叶宽明显小于野生型和过表达株系，且失水速率最低。同时，显微观察表明，干涉株系的气孔明显小于其他株系。通过实时定量PCR检测气孔发育相关基因发现，过表达株系中OsTMM、OsSPCH1、OsMUTE和OsFAMA的表达呈显著上调趋势，而干涉株系中，呈现与之相反的显著下调趋势，表明OsVPE3通过影响气孔发育相关基因，使气孔变小，影响叶片蒸腾速率。
　　6.OsVPE3蛋白成熟切割及其互作蛋白研究
　　在原生质体瞬时表达系统中，利用IP技术富集OsVPE3-GFP，发现OsVPE3成熟需进行C端切割。通过免疫共沉淀技术和质谱分析，分离纯化了OsVPE3-GFP及其可能互作的蛋白，推测参与应激反应的DnaK family protein和参与膜泡运输的SNARE protein与OsVPE3互作的可能性最大。
　　以上结果表明: OsVPE3能通过调控液泡破裂参与盐胁迫诱导的细胞程序性死亡，此外，OsVPE3还具有影响种子和气孔发育的作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

前言

1．1 植物细胞程序性死亡

1．1．1 植物的营养生长与PCD

1．1．2 植物的生殖生长与PCD

1．1．3 植物的逆境胁迫与PCD

1．2 液泡加工酶介导PCD发生

1．2．1 植物液泡的功能

1．2．2 液泡加工酶的分类和功能

1．2．3 液泡加工酶参与发育过程中的PCD

1．2．4 液泡加工酶参与胁迫引起的PCD

1．3 气孔发育的分子机制

1．3．1 气孔发育模式

1．3．2 气孔发育的分子调控机制

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验试剂与仪器

2．3 植物组织DNA提取

2．4 植物组织RNA提取

2．5 定量PCR

2．5．1 逆转录反映

2．5．2 实时定量PCR

2．6 水稻盐胁迫处理

2．6．1 盐胁迫下水稻幼苗根长测定

2．6．2 盐胁迫处理4周水稻苗

2．7 叶绿素提取

2．8 DNA laddering检测

2．9 原生质体制备及染色

2．9．1 无菌苗培养

2．9．2 原生质体的提取

2．9．3 BCECF和Trypan Blue染色及显微观察

2．10 CO-IP

2．11 Western Blot

2．11．1 SDS-PAGE电泳

2．11．2 转膜

2．11．3 封闭和杂交

2．11．4 显影

2．12 SDS-PAGE银染

第三章 实验结果

3．1 过表达和干涉的OsVPE3转基因株系鉴定及其种子表型观察

3．1．1 过表达和干涉的OsVPE3转基因株系鉴定

3．1．2 过表达和干涉的OsVPE3转基因株系种子表型

3．1．3 OsVPE3表达谱分析

3．2 盐胁迫下OsVPE3介导植物细胞程序性死亡

3．2．1 盐胁迫下OsVPE3干涉株系抗性提高

3．2．2 盐胁迫下OsVPE3介导水稻根尖细胞程序性死亡

3．2．3 盐胁迫下OsVPE3通过介导液泡破裂引起水稻原生质体死亡

3．3 OsVPE3对水稻叶宽及气孔发育的影响

3．3．1 过表达和干涉的OsVPE3转基因株系叶片表型比较

3．3．2 OsVPE3通过调控OsTMM和气孔发育相关转录因子改变气孔大小

3．3．3 过表达和干涉的OsVPE3转基因株系叶片失水速率比较

3．4 OsVPE3蛋白加工成熟及互作蛋白探索

3．4．1 OsVPE3加工成熟需进行C端切割

3．4．2 OsVPE3蛋白免疫共沉淀的Western和银染检测

3．4．3 免疫共沉淀复合物质谱分析

第四章 讨论与展望

4．1 OsVPE3通过介导液泡破裂引起程序性细胞死亡

4．2 OsVPE3影响叶片和气孔发育调控叶片蒸腾效率

4．3 OsVPE3蛋白的加工成熟和互作蛋白研究

参考文献

致谢