Gelsolin在体外循环术后急性肺损伤及TRIM22调控炎症反应的作用及机制

摘要

第一部分血浆gelsolin与婴幼儿体外循环术后急性肺损伤的研究
　　目的:
　　体外循环术后急性肺损伤是在CPB术下行心脏手术的患者最常见且严重的并发症之一，尤其是婴幼儿。本研究拟通过调查婴幼儿（≤3岁）行体外循环术下心脏手术围术期血浆中gelsolin的水平变化情况，确定pGSN的水平是否与体外循环术后肺损伤的发生和严重程度有相关性，以期建立体外循环术后ALI可靠的生物学预警指标，为其防治提供有效的分子靶标。
　　方法:
　　该研究在浙江大学医学院附属儿童医院Surgery Intensive Care Unit(SICU)进行，将从2012年11月至2013年3月期间入住该院，并在体外循环术下行心脏手术的先天性心脏病患儿（年龄≤3岁）纳入研究。该研究获得浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会的批准，并且患儿的监护人已签订知情同意书。患儿根据欧美联席会议制定的相关标准被分为ALI组和非ALI组。分别于以下八个时间点:体外循环术前、体外循环术后、术后2小时、术后6小时、术后12小时、术后24小时、术后48小时和术后72小时取其外周血，置入EDTA管，离心留血浆，ELISA法检测血浆gelsolin的水平。采用双因素ANOVA分析各组患儿围体外循环pGSN和标准化pGSN(pGSNN)的水平变化规律，协方差分析法(ANCOVA)分析两组患儿pGSN和pGSNN水平的差异，Logistic回归法分析体外循环术后急性肺损伤发生的独立危险因素，并通过绘制ROC曲线，分析gelsolin敏感性和特异性，计算临界值。P值小于0.05被认为有统计学差异。数据使用SPSS16.0软件进行统计学分析。
　　结果:
　　在本研究纳入的77名患儿中，有27名患儿(35.1％)发生体外循环术后肺损伤，包括11名患儿(14.3％)发展为ARDS。ALI组患儿术后6小时pGSN和pGSNN水平较基础值显著下降（P=0.04及P＜0.01），明显早于非ALI组（48小时，P=0.03及24小时，P＜0.01）。ALI患儿CPB术前及术后6小时pGSN水平均显著低于非ALI组(P＜0.01，P＜0.01)，pGSNN水平在ALI组患儿术前及术后6小时亦显著低于非ALI组（P＜0.01及P=0.04）。CPB术前血浆gelsolin水平是婴幼儿体外循环术后急性肺损伤发生的独立危险因素(OR，1.023;95％CI，1.007-1.039; P＜0.01)，在ROC分析中，CPB术前pGSN的AUC为0.753(95％CI，0.626-0.880)，最佳界值为264.2mg/L，灵敏度为58.3％，特异度为94.7％。且术前pGSN的水平与婴幼儿体外循环术后急性肺损伤的严重程度呈负相关(r=-0.457，P＜0.01)。
　　结论:
　　婴幼儿体外循环术后急性肺损伤患儿血浆基础gelsolin水平低，术后血浆gelsolin迅速且大量消耗。血浆基础gelsolin水平可作为婴幼儿体外循环术后急性肺损伤早期且敏感的预测指标，并与急性肺损伤的严重程度呈负相关。
　　第二部分 Gelsolin在急性肺损伤发生发展中的作用及机制
　　目的:
　　研究表明，在某些肺损伤模型中，pGSN水平的下降可诱导并加重肺损伤，而外源性补充gelsolin制剂，能够明显减轻急性肺损伤引发的肺微循环渗透性增加、缓解肺部炎症浸润，减轻肺损伤的严重程度。因此，本研究拟通过建立新西兰幼兔在体单肺缺血-再灌注损伤模型，探讨肺组织gelsolin表达和分布及其在肺损伤发生发展中的作用以及外源性gelsolin应用对肺损伤的保护作用。
　　方法:
　　建立新西兰幼兔(400-500g)在体单肺缺血(60min)-再灌注(30、60、120min)损伤模型，分别于阻断前、再灌注即刻、再灌注30min、60min和120min抽血，观察各组氧合能力的变化。ELISA法测定各组，即无缺血组、再灌注30min、60min和120min组，肺泡灌洗液(BALF)及血浆gelsolin水平，分析gelsolin与肺损伤发生发展的关系。建立新西兰幼兔在体单肺缺血-再灌注(I/R:60/120min)损伤模型，实验组于术前30min予静脉注射胎牛gelsolin（7.8mg/kg，iv），通过观察实验组氧合能力、肺血管通透性、BALF及血浆细胞因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10)的变化以及炎症局部及全身中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)的渗出情况综合评价外源性gelsolin对肺损伤的保护作用。
　　结果:
　　幼兔在体单肺缺血(60min)再灌注后，氧分压于再灌注30min、60min和120min时显著降低，低氧程度与再灌注时间呈负相关(r=-0.627，p＜0.01)，经气管插管取肺泡灌洗液(BALF)，gelsolin水平随着再灌注时间延长显著增加(p＜0.01)，而血浆gelsolin水平各实验组无显著性差异。外源性补充gelsolin（7.8mg/kg，iv）能够显著改善幼兔氧合能力(p＜0.01)，减轻肺血管通透性，减少BALF中的蛋白渗出(p=0.019)，降低BALF及血浆TNF-α水平（p＜0.01和p＜0.01），肺髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性显著降低(P＜0.01)，血浆白细胞总数及PMN数量均显著下降（p＜0.01和P＜0.01）。
　　结论:
　　幼兔在体单肺缺血再灌注后，氧合能力显著降低，并与再灌注时间呈负相关;BALF中gelsolin水平显著增加，而血浆gelsolin水平与缺血再灌注时间无显著相关。外源性gelsolin预处理对肺损伤具有保护作用。
　　第三部分 TRIM22调控单核细胞炎症反应的作用及机制
　　目的:
　　体外循环术后全身炎症反应综合症是急性肺损伤最主要的机制，体外循环术可以引起全身炎症反应，使肺泡上皮细胞和血管内皮细胞遭到破坏，引起并加重肺损伤。积极寻找并研究体外循环相关炎症反应的调控因子对防治急性肺损伤有着重要的临床意义。单核细胞是炎症反应的重要参与者，同时也是模式识别受体被激活时促炎因子和抗炎因子的主要产生者。因此，深入探讨单核细胞调控炎症反应的机制有助于体外循环术后全身炎症反应控制的研究。TRIM22，可被干扰素诱导表达，是TRIM蛋白家族成员之一，在单核细胞中高表达。既往研究证实，TRIM22对多种病毒具有抵抗作用、调节细胞增殖和活化。人TRIM22在小鼠中的同源基因TRIM30，可以抑制炎症反应。前期研究已证实TRIM22在脓毒症患者外周血单核细胞中的表达较非脓毒症组中的表达降低（数据尚未发表），根据既往研究，我们推测TRIM22可能与炎症调控有相关性，但机制仍不明确。因此，本研究拟建立体外细胞水平模拟的炎症环境，探讨TRIM22与炎症调控的作用及相关机制，以期对体外循环术后SIRS的理解起指导作用，为今后体外循环术后ALI的防治提供新的治疗靶点。
　　方法:
　　LPS刺激人单核细胞系THP-1细胞，体外模拟炎症环境，real time PCR和Western Blot法检测TRIM22的表达。构建编码TRIM22的腺病毒，并转染THP-1细胞，real time PCR和Western Blot法检测TRIM22过表达情况。Q-PCR和ELISA法检测细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。Western Blot法检测自噬相关蛋白和HO-1的变化。
　　结果:
　　LPS刺激人单核细胞THP-1，体外模拟炎症环境，可引起TRIM22在mRNA和蛋白水平的表达增高。过表达TRIM22后，给予LPS刺激，TRIM22组TNF-α和IL-1β的表达较LacZ组明显下降（73.41±6.49 vs.34.84±3.92pg/ml，P＜0.0001;90.64±8.91 vs.45.24±9.97pg/ml，P＜0.0001）。LPS刺激THP-1细胞，自噬水平和血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)的表达上调;过表达TRIM22的THP-1细胞，在LPS刺激下其自噬水平以及HO-1的表达较对照组明显增高;抑制自噬后，炎症因子表达增高。
　　结论:
　　过表达TRIM22可负向调控单核细胞炎症反应，其机制可能与TRIM22在LPS环境下上调自噬和HO-1相关。

目录

声明

致谢

前言

摘要

中英文缩写词对照表

引言

参考文献

第一部分 血浆gelsolin与婴幼儿体外循环术后急性肺损伤的研究

1 材料与方法

1．1 实验试剂和器材

1．2 研究对象和方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 具体临床资料

2．2 围手术期血浆gelsolin和总蛋白的浓度

2．3 术前低血浆gelsolin水平是体外循环术后肺损伤的预警因子

2．4 术前血浆gelsolin水平与体外循环术后肺损伤的严重程度呈负相关

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 Gelsolin在急性肺损伤发生发展中的作用及机制

1 材料与方法

1．1 实验试剂和器材

1．2 实验方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 肺组织gelsolin的表达与肺损伤发生发展的相关性

2．2 外源性gelsolin干预对肺损伤具有保护作用

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 TRIM22调控单核细胞炎症反应的作用及机制

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2 结果

2．1 TRIM22在LPS刺激的THP-1细胞中的表达

2．2 TRIM22在THP-1细胞中的过表达

2．3 TRIM22对单核细胞促炎因子的调控

2．4 TRIM22调节自噬的水平

2．5 TRIM22调节血红素氧合酶-1(HO-1)的水平

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

Gelsolin的生物学功能及在肺脏相关疾病中的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果