HIF-1α抑制剂PX-478在自噬介导的口腔鳞状细胞癌糖基化中的研究

摘要

目的:
　　口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。以局部侵袭性为特征的肿瘤，高表达缺氧水平。肿瘤性缺氧直接依赖于缺氧诱导因子(HIF)。肿瘤缺氧和代谢密切相关，由于O-糖基化功能上的重要性，目前是肿瘤代谢重要的研究热点。通过口腔鳞癌组织和细胞学的研究，初步探讨O-糖基化和口腔鳞状细胞癌关系。通过舌鳞癌细胞株Tca8113探讨抑制自噬对口腔鳞状细胞癌O-糖基化的影响。描述缺氧诱导因子HIF-1α的基本生物学特性和口腔鳞状细胞癌自噬对糖基化的影响，通过对癌细胞进行缺氧抑制剂诱导的糖基化的调节，探索其在口腔鳞状上皮癌中的自噬作用。以及评估其作为药物治疗靶点的可能途径。
　　方法:
　　1.对30例口腔鳞状细胞癌和10例正常口腔黏膜组织，采用免疫组织化学SP法检测O位N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)的表达。
　　2.人体Tca8113细胞株用免疫荧光检测在糖基化增强剂(transglycosylation，TG)和糖基化抑制剂(deoxynorleucine，DON)作用下舌鳞状细胞癌TCA8113细胞的增殖。
　　3.小干扰RNA(siRNA)转染阻断人体ATG12和ATG1。检测HIF-1α抑制剂PX-478作用下糖基化相关蛋白表达。
　　4.采用蛋白免疫印迹方法，来检测自噬和糖基化相关的蛋白表达。
　　结果:
　　1.O-GlcNAc和OGT在正常口腔黏膜组织和口腔鳞癌组织中存在表达显著性差异(P＜0.05)，并且随着肿瘤恶性程度的增高，呈现表达升高的趋势。OGA的表达和O-GlcNAc、 OGT均不同，从正常组织到鳞癌中表达呈增高趋势，但在不同分化鳞癌组内表达差异不明显。TG可促进TCA8113的增殖和O-GlcNAc、OGT的表达，DON可抑制TCA8113的增殖和O-GlcNAc、OGT的表达。
　　2.Atg12 siRNA和Atg1 siRNA导致LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化减少。在经过Atg12 siRNA和Atg1 siRNA转染Tca8113，ATG12和ATG1阻断的作用下，O-GlcNAc与OGT的蛋白表达增高，显示抑制自噬可以引起O-GlcNAc与OGT蛋白在Tca8113细胞的聚积。
　　3.在PX-478处理过的Tca8113细胞中，O-GlcNAc糖基化现象具有多样化。HIF-1α抑制剂PX-478处理过的Tca8113细胞中O-GlcNAc表达降低，而OGT表达减少，OGA表达增加。 PX-478对OGT和OGA的表达作用结果相反，而O-GlcNAc的表达趋势与OGT相似。PX-478处理4-16个小时内Tca8113细胞的OGT含量逐渐减少。
　　4.自噬反应的诱导引起了LC3-Ⅰ的转换，在Atg12-Atg5-Atg16L复合体的作用下生产出自杀式的LC3-Ⅱ。当自噬反应被HIF-1α抑制剂PX-478(0，5，和25μM)处理后减少了，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的数量也降低。自噬小体随PX-478剂量的提升而减少。结果提示阻断HIF-1α可以减少自噬现象的发生。
　　5.为了明确自噬反应和HIF-1α是否参与调节糖基化，由于O-GlcNAc的表达与OGT相关，本实验在自噬和HIF-1α抑制同时进行的过程中检测OGT的蛋白水平。在Atg12和Atg1 siRNA以及PX-478处理后，OGT的表达在0，8，16，24，36和48小时内的波动在最初的24小时内有一定减少，然后缓慢上升。因此，我们认为OGT蛋白表达的不稳定性在最后阶段主要是由于自噬作用的影响，其次是因为开始阶段HIF-1α的抑制。免疫荧光显示LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ在48小时内完全被抑制。
　　结论:
　　1.O-糖基化在口腔鳞状细胞癌中表达增高，在舌鳞癌细胞系中活化，抑制剂DON可抑制肿瘤细胞增殖。
　　2.HIF-1α抑制剂PX-478导致LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ在Tca8113细胞中数量的减少，同时，降低了O-GlcNAC和OGT在癌细胞中的表达，提高了OGA的表达。O-GlcNAC的下降趋势与OGT相似。
　　3.O-GlcNAC和OGT的蛋白水平在ATG12和ATG1消耗下提高。
　　4.OGT的表达在Atg12和Atg1 siRNA的处理后和PX-478波动下先下降后缓慢升高。当HIF-1α信号通道被阻断后，细胞自噬影响OGT的稳定性。
　　5.自噬现象受缺氧抑制的影响而减少。HIF-1α抑制剂减少了癌细胞的糖基化形成。在HIF-1α信号通路阻断后，OGT蛋白由于自噬现象的消失而不稳定。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词中英文对照表

序言

参考文献

第一章 O-糖基化在口腔鳞状细胞癌发生发展中的作用

1．1 研究背景

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4．讨论

1．5 结论

参考文献

第二章 抑制自噬对口腔鳞状细胞癌O-糖基化的影响

2．1 研究背景

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第三章 HIF-1α抑制剂PX-478和口腔鳞状细胞癌O-糖基化的关系

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

第四章 HIF-1α抑制剂PX-478在自噬介导的口腔鳞状细胞癌糖基化中的研究

4．1 研究背景

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4．讨论

4．5 结论

参考文献

综述

作者简介及在读期间所取得的科研成果