睾丸孤核受体4(TR4)在肾透明细胞癌侵袭转移中作用及其机制的研究

摘要

目的:
　　肾透明细胞癌(Clear Cell Renal cell carcinoma, ccRCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是常见的泌尿系统恶性肿瘤。肾透明细胞癌起病较隐匿，大多无典型的临床表现，早期诊断率不高，其中大约30％患者在诊断时已发生转移，失去手术机会。转移性肾透明细胞癌的治疗目前主要依赖靶向治疗，但其平均有效时间仅6-15个月。因此，深入研究肾透明细胞癌转移的机制，寻求更好的治疗转移性肾透明细胞癌的方法显得尤为重要。
　　近两年我们的研究发现TR4可以通过CCL2/CCR或者miR-373-3p促进前列腺癌的迁移和侵袭，亦可影响前列腺癌干细胞的侵袭和迁移能力促进前列腺癌转移，并且我们也发现TR4可以促进前列腺癌的化疗抵抗和放疗抵抗。TR4在前列腺癌转移以及前列腺癌放化疗抵抗中的作用已逐渐得到研究人员的认可并引起重视，而关于TR4在肾癌中的作用尚未见报道。
　　在本研究中，我们探索了TR4在ccRCC侵袭转移中的作用，并通过运用分子生物学方法阐述其具体机制。
　　方法和结果:
　　1.TR4在人类ccRCC组织标本和细胞株中的表达、与患者预后相关性及其在ccRCC侵袭转移中功能的研究
　　我们通过对ccRCC患者组织标本进行免疫组织化学染色发现转移性ccRCC患者肾癌组织中TR4表达明显高于非转移性ccRCC患者，并且通过TCGA数据库发现TR4与ccRCC患者的预后呈负相关，进一步在细胞水平发现TR4在侵袭能力较强的ccRCC细胞株中表达相对较高，并且通过调控细胞株内TR4表达水平在细胞进一步验证TR4促进ccRCC侵袭转移的作用。
　　2.TR4通过miR-32-5p/TR4/HGF/Met信号通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究
　　我们运用Western blot、ChIP、双荧光素酶报告基因实验、拯救实验等方法在细胞层面证明TR4可以通过转录调控上调HGF/Met/MMP2/MMP9通路的表达促进ccRCC侵袭转移，miR-32-5p可以抑制TR4及TR4下游通路HGF/Met/MMP2/MMP9的表达进而抑制ccRCC侵袭转移，并且miR-32-5p可以通过与TR43'UTR的结合抑制TR4的表达。最后通过动物实验进一步验证细胞实验的结果。
　　3.TR4通过上调circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究
　　我们运用qRT-PCR、Western blot、ChIP、双荧光素酶报告基因实验、拯救实验、RNA-pulldown等方法证明TR4可以通过转录调控上调circ_000002的表达，而circ_000002可以和miR-19s-3p、miR-29s-3p结合，影响其分布进而促进其下游IGF-1的表达，最终促进ccRCC侵袭转移。
　　结论:
　　本研究在ccRCC组织标本中发现TR4在转移性ccRCC中高表达，并在细胞层面、动物层面验证TR4可以促进ccRCC侵袭转移，进一步在细胞层面探索其具体机制发现TR4可以通过上调HGF/Met/MMP2/MMP9通路活性促进ccRCC侵袭转移，并且发现其上游分子miR-32-5p可以靶向TR4抑制TR4的表达及其下游HGF/Met/MMP2/MMP9通路。此外我们也发现TR4也可以通过上调circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1通路活性促进ccRCC侵袭转移。

目录

声明

致谢

摘要

英汉缩略语名词对照

1 引言

2 第一部分 TR4在人类ccRCC组织标本和细胞株中的表达、与患者预后相关性及其在ccRCC侵袭转移中功能的研究

2．1 材料和仪器

2．1．1 人类ccRCC组织标本

2．1．2 细胞系

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 临床资料

2．2．2 免疫组织化学染色

2．2．4 TCGA数据库数据分析

2．2．5 细胞培养

2．2．6 细胞复苏

2．2．7 细胞传代

2．2．8 细胞冻存

2．2．9 Transwell细胞侵袭实验

2．2．10 细胞蛋白提取

2．2．11 蛋白质免疫印迹(Western blot)

2．2．12 TR4过表达和敲低质粒的构建

2．2．13 慢病毒的制备

2．2．14 慢病毒感染

2．2．15 细胞总RNA的提取

2．2．16 RNA逆转录成cDNA

2．2．17 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

2．2．18 统计学方法

2．3 实验结果

2．3．1 TR4在转移性ccRCC组织中高表达

2．3．2 ccRCC患者肾癌组织中TR4的表达量与无复发生存率呈负相关

2．3．3 ccRCC患者肾癌组织中TR4的表达量与总生存率呈负相关

2．3．4 侵袭能力较强的ccRCC细胞株TR4表达较高

2．3．5 TR4过表达的ACHN细胞系和TR4敲低的OSRC-2细胞系的鉴定

2．3．5 TR4表达水平对ACHN细胞系和OSRC-2细胞系侵袭能力的影响

2．3 小结

3 第二部分 TR4通过miR-325p／TR4／HGF／Met信号通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究

3．1 材料和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay,ChIP)

3．2．2 双荧光素酶报告基因实验(Dual-Luciferase Reporter Assay)

3．2．3 质粒点突变

3．2．4 miR-32-5p过表达慢病毒载体的设计

3．2．5 切胶回收目的片段

3．2．6 感受态大肠杆菌转化

3．2．7 质粒抽提

3．2．8 质粒转染

3．2．9 ccRCC原位移植瘤裸鼠模型的建立

3．2．10 统计学方法

3．3 实验结果

3．3．1 CCL2／CCR通路和miR-373-3p／TGFβR2／p-Smad3通路不是TR4促进ccRCC侵袭转移的下游通路

3．3．2 TR4可以调控HGF及其下游phospho-Met、MMP2和MMP9的表达

3．3．3 HGF／Met通路介导TR4促进ccRCC侵袭转移

3．3．4 TR4通过结合HGF基因的启动子促进HGF表达

3．3．5 miR-32-5p可以靶向TR4并抑制TR4的表达

3．3．6 miR-32-5p可以抑制ccRCC侵袭转移

3．3．7 miR-32-5p可以抑制TR4／HGF／Met通路

3．3．8 TR4／HGF／Met通路介导miR-32-5p抑制ccRCC侵袭转移

3．3．9 miR-32-5p抑制TR4表达的具体机制

3．3．9 ccRCC原位移植瘤裸鼠模型验证miR-32-5p和TR4在ccRcc侵袭转移中的作用

3．3 小结

4 第三部分 TR4通过上调circ_000002／miR-19s-3p／miR-29s-3p／IGF-1通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究

4．1 材料和仪器

4．2 实验方法

4．2．1 设计circ_000002特异性qRT-PCR检测引物并用RNase R验证

4．2．2 构建circ_000002敲低的慢病毒载体

4．2．3 构建过表达circ_000002的慢病毒载体

4．2．4 RNA-pull down实验

4．2．5 统计学方法

4．2．6 实验结果

4．2．7 TR4可以调控citc_000002的表达

4．2．8 circ_000002敲低和过表达细胞系的建立及鉴定

4．2．9 circ_000002可以促进ccRCC侵袭转移

4．2．10 circ_000002介导TR4对ccRcc侵袭转移的促进作用

4．2．11 TR4调控circ_000002的具体机制

4．2．12 circ_000002可以与miR-19s-3p和miR-29s-3p结合

4．2．13 miR-19s-3p和miR-29s-3p介导circ-000002对ccRCC侵袭转移的促进作用

4．2．14 IGF-1是TR4／circ_000002／miR-19s-3p／miR-29s-3p的下游靶基因

4．3 小结

5 讨论

6 结论和展望

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果