钙结合蛋白S100P在胎盘滋养细胞的表达与功能研究

摘要

胎盘滋养细胞在人类妊娠早期胚泡植入过程中发挥着重要作用，滋养细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等功能适度是生理妊娠建立、维持和适时终止的关键。功能过强可能发生滋养细胞肿瘤（如葡萄胎、绒毛膜癌等）;过弱则可导致妊娠失败（如自然流产、早产等）和病理妊娠（如子痫前期、胎儿宫内生长受限等）。滋养细胞功能异常的分子机制一直被广泛研究，然而通过何种关键性靶分子，经过何种细胞途径作用于滋养细胞，从而引起增殖、侵袭等生物学行为改变的分子生物学机制尚不明确。
　　S100P是钙结合蛋白S100家族的一员，在人类胎盘组织中首次被检测到，其发现即预示着与妊娠关系密切。然而，目前尚没有文献报道S100P在人类妊娠不同阶段胎盘组织的表达和分布——也没有报道S100P与滋养细胞功能之间的关系。
　　本研究首先检测了S100P在正常妊娠不同阶段胎盘组织的表达模式，并比较了自然流产及妊娠滋养细胞肿瘤中S100P表达的差异;其次，通过体外细胞实验及体内动物实验来研究S100P对滋养细胞生物学功能的影响及可能的分子作用机制。本研究旨在探讨S100P表达与胎盘滋养细胞功能的相关性，
　　第一部分 S100P在胎盘组织中的表达
　　目的:
　　探讨S100P在正常妊娠不同阶段绒毛或者胎盘组织以及早孕期自然流产绒毛组织以及妊娠滋养细胞肿瘤中的表达。
　　方法:
　　利用RT-PCR、定量实时PCR、western-blot以及免疫组织化学染色法检测S100P在胎盘组织中的表达。
　　(1)收集正常妊娠不同阶段绒毛或胎盘组织，包括12个早孕期绒毛组织，10个中孕期胎盘组织，和12个足月妊娠胎盘组织，检测S100P在绒毛和胎盘组织的表达与定位。
　　(2)比较16个早孕期自然流产与12个早孕期正常妊娠绒毛组织，比较两组S100P表达量的差异;
　　(3)收集了23例妊娠滋养细胞肿瘤的组织样本，10例葡萄胎、3例侵袭性葡萄胎、10例绒毛膜癌，其中5例同时具有原发灶组织和转移灶组织;对葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌原发灶及转移灶组织的S100P蛋白表达进行免疫组化表达分析。
　　结果:
　　(1)S100P在整个妊娠阶段早孕期、中孕期以及足月妊娠绒毛或胎盘组织均呈高表达，相比较而言，早孕期绒毛组织的S100P mRNA和蛋白表达水平更高一些。免疫组化法检测到S100P蛋白在绒毛合体滋养细胞强阳性表达，细胞滋养细胞发现中等强度表达。S100P在合体滋养细胞的细胞核及细胞浆均呈强阳性表达，而在细胞滋养细胞及细胞滋养细胞柱只表达于细胞浆。在中孕期与足月妊娠胎盘，S100P在合体滋养细胞的细胞核和细胞浆表达。
　　(2)与早孕期正常妊娠绒毛组织相比，自然流产绒毛组织的S100P蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。
　　(3)在妊娠滋养细胞肿瘤标本中，10例葡萄胎组织的免疫组化结果显示，部分病人(3/10) S100P蛋白在合体滋养细胞为强阳性，在细胞滋养细胞为中等强度阳性或强阳性表达;而在3例侵蚀性葡萄胎(3/3)、6例绒毛膜癌原发灶(6/10)和5例肺转移灶组织(5/5)中，细胞滋养细胞S100P均为强阳性表达。
　　结论:
　　S100P在正常妊娠不同阶段胎盘滋养细胞的特异性表达和分布显示其在滋养细胞的功能可能随着定位不同发生改变。S100P在早孕期自然流产绒毛组织中表达量下降且在良恶性滋养细胞肿瘤表达存在差异，提示S100P与胎盘滋养细胞的功能可能存在一定的关系，但具体作用与可能的分子机制还有待进一步验证。
　　第二部分 S100P对滋养细胞生物学功能的影响及分子机制探讨
　　目的:
　　探讨S100P对滋养细胞生物学行为的影响及可能的分子机制。
　　方法:
　　体外细胞实验部分:培养JAR和JEG-3滋养细胞系，构建真核表达载体和小干扰RNA分别转染JAR细胞和JEG-3细胞。不同分组滋养细胞分别用XTT细胞生长实验、细胞凋亡实验、平板克隆形成实验及transwell细胞迁移实验分析S100P对滋养细胞生长、凋亡、克隆形成及迁移能力的影响。体内动物实验部分:应用裸鼠体内成瘤实验和尾静脉注射转移瘤实验观察S100P对滋养细胞体内成瘤能力和细胞转移能力的影响。为了进一步探讨S100P的作用机制，我们用western-blot检测P38信号通路相关分子在JAR细胞中的作用。
　　结果:
　　(1)构建S100P真核表达载体和S100P小干扰RNA（siRNA1、siRNA2），转染滋养细胞系JAR和JEG-3。转染质粒过表达S100P的JAR和JEG-3细胞均比对照组（空载体转染组）细胞生长能力增快，细胞克隆形成能力增加，且细胞体外迁移能力亦明显增加(P＜0.05)。与之相反，转染小干扰RNA的滋养细胞生长能力要明显慢于对照组，且细胞克隆形成能力降低，体外迁移能力也降低(P＜0.05)。
　　(2)我们接着检测上调S100P的表达水平对裸鼠体内成瘤能力和尾静脉注射转移瘤形成的影响，结果显示，与转染空载体的对照组细胞相比，S100P过表达滋养细胞形成的肿瘤体积明显大于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。同时，转移瘤实验显示S100P过表达组JAR细胞在裸鼠体内转移能力显著增强(P＜0.05)。
　　(3)进一步分子机制实验结果显示S100P过表达后滋养细胞JAR的P-P38和P-ERK表达升高;利用抑制剂SB203580阻断P38 MAPK，上调S100P的表达不能促进JAR细胞的增殖作用，而ERK通路抑制剂PD98059阻断后对S100P引起的细胞增殖没有作用。
　　结论:
　　S100P可以促进滋养细胞的体外增殖、克隆、迁移能力以及体内成瘤和转移能力，且S100P可能通过P38MAPK信号途径促进滋养细胞的增殖。

目录

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致谢

论文说明

摘要

缩略词表

第一部分 S100P在胎盘滋养细胞中的表达

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

参考文献

第二部分 S100P对滋养细胞生物学行为的影响以及分子机制探讨

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

参考文献

全文结论和创新点

附图

综述一 钙结合蛋白S100P在妇产科领域的研究进展

综述二 早期子宫内膜癌患者保留生育功能的治疗及妊娠结局

附表

作者简历及在学期间所取得的科研成果