mPEG-SeSE-PEI载体介导在胰腺癌细胞PANC-1中siRNA转染效果的探讨

摘要

目的:
　　PEG-SeSe-PEI是一种新型基于PEI的GSH浓度响应的聚合物载体。它的主要结构特点是用双硒键链接PEG和PEI，它利用了细胞内的GSH浓度较细胞外高，在GSH浓度较高的环境中，双硒键在容易断裂，载体稳定性下降，有助于pDNA从内涵体中逃逸，从而提高转染效率。研究表明:mPEG-SeSe-PEI在向HepG2细胞转染质粒时，比PEI，PEG-PEI和PEG-SS-PEI有更高的转染效率，同时其毒性相对较小。pDNA和siRNA的转染之间还是有很多不同之处，但是，目前还没有应用mPEG-SeSe-PEI运载siRNA的研究，我们通过利用mPEG-SeSe-PEI载体向胰腺癌细胞系PANC-1细胞转染siGADPH，来探讨mPEG-SeSe-PEI的细胞毒性及转染效果，并期望能找到合适的PEG枝化水平，N/P比值，以便我们进行后续的实验。
　　方法:
　　1、分别合成mPEG-SeSe-PEI以及PEG11.8-PEI聚合物，然后用聚合物与siGADPH混合形成了不同的组装体。
　　2、应用琼脂糖凝胶电泳实验测定了mPEG-SeSe-PEI、 PEG11.8-PEI以及PEI对 siGADPH的包封效率。
　　3、通过细胞细胞流式技术(FCM)测定不同载体在不同N/P比值时的转染效率。
　　4、用激光粒径仪测定在不同N/P比值时的组装体粒子的Zeta-电位以及粒径，并使用透射电镜(TEM)观察了粒子大小及微观形态。
　　5、用MTT法测定mPEG-SeSe-PEI，PEG11.8-PEI，PEI以及Lipo2000对PANC-1细胞的毒性。
　　6、通过共聚焦显微镜(CLSM)观察PANC-1细胞中的荧光强度，进一步证实不同组装体的内化效率。
　　7、通过荧光定量RT-PCR测定了不同组装体对PANC-1细胞GADPH mRNA的干扰效果，同时观察了血清对不同转染试剂转染效果的影响。
　　结果:
　　1、合成了mPEG-SeSe-PEI，PEG11.8-PEI以及不同N/P比值的siGADPH组装体。
　　2、PEI,PEG11.8-PEI,PEG5-SeSe-PEI,PEG69-SeSe-PEI和PEG11.6-SeSe-PEI能完全包封siGADPH的N/P比值分别是:5，10，8，8，10。
　　3、PEI/siRNA(N/P=20), PEG5-SeSe-PEI/siRNA(N/P=5), PEG6.9-SeSe-PEI/siRNA(N/P=15)，PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA(N/P=10)和PEG11.8-PEI/siRNA(N/P=10)的转染效率最高，分别为54.1％、43.6％、59.8％、73.8％和75.7％。
　　4、检测了不同siGADPH组装体的粒径和Zeta-电位，结果见后文。
　　5、组装体的毒性呈N/P比值依赖的，N/P比值越大，组装体的细胞毒性越大。PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA(N/P=10)的细胞毒性相对于Lipo2000/siRNA较低。
　　6、用Lipo2000/siRNA，PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA和PEG11.8-PEI/siRNA转染的细胞内的红色荧光强度显著高于PEI/siRNA转染的细胞。
　　7、PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA(N/P=10)的干扰效率高于其他组装体且较为稳定。
　　结论:
　　1、在N/P≧10时，PEG11.6-SeSe-PEI可以完全包封siRNA，且PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA(N/P=10)的形态呈球形纳米颗粒，分布较为均匀。
　　2、PEG11.6-SeSe-PEI/siRNA表现出较低的细胞毒性，较高的细胞内化效率和明显的RNAi效果，且血清蛋白的存在环境较为稳定。
　　3、因此，PEG11.6-SeSe-PEI是一种性能良好的siRNA载体，有一定的临床应用潜力。

目录

声明

致谢

序言

摘要

缩略词表

1、绪论

2、材料和方法

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂

2．3 胰腺癌细胞系

2．4 主要溶液的配制

2．5 实验方法

3、实验结果

3．1 各种聚合物以及siGADPH组装体的制备

3．2 琼脂糖凝胶电泳实验

3．3 转染siRNA效率检测

3．4 siGADPH组装体的粒径和Zeta-电位

3．5 MTT检测细胞毒性实验

3．6 共聚焦激光扫描显微镜结果

3．7 在GADPH mRNA水平上的干扰效率

4、讨论

5、结论

参考文献

综述 siRNA载体目前的研究进展以及展望

作者简历及在学期间所取得的科研成果