合欢皮皂苷基质佐剂的研制及药效学研究

摘要

免疫刺激复合物(Immunostimulatory complexes，ISCOMs)是由皂苷、胆固醇、磷脂和抗原构成的抗原提呈系统。ISCOMATRIX佐剂是在ISCOMs基础上发展起来的，其组成和结构本质上和ISCOMs相同，只是不含抗原。ISCOMs和ISCOMATRIX保留皂苷佐剂活性的同时可降低后者的溶血性和毒性。此外，作为一种微粒抗原提呈系统，与抗原和皂苷的简单混合物相比，较少的抗原及皂苷就能诱导机体产生较强的免疫反应。
　　AJS系从豆科植物合欢Albizzia julibrissin的干燥茎皮中筛选到的佐剂活性皂苷有效部位。前期研究结果表明:AJS对卵清蛋白(OVA)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗、猪O型口蹄疫灭活疫苗、猪瘟弱毒活疫苗、猪伪狂犬gE基因缺失活疫苗等均具有显著的佐剂作用，能同时诱生机体对抗原产生Th1和Th2免疫应答反应，且溶血性和毒性低于Quil A，是一种理想的候选疫苗佐剂。鉴于AJS主要成分的化学结构与Quil A相似，均属齐墩果烷型三萜皂苷，苷元的C3、C28位OH糖基化，且含单萜烯酸酯结构，本项目以AJS替代Quil A，研制新型、通用型合欢皮皂苷基质佐剂(Albiziasaponins-based matrix adjuvant，ASMA)，并研究对OVA、猪O型口蹄疫灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗的佐剂作用，为其进一步的研究开发提供科学依据。
　　1.ASMA制备工艺研究
　　以佐剂活性为评价指标，选择膜材比、孵育温度和孵育时间三个关键因素，采用正交试验方法优化ASMA的处方及制备工艺条件:脂药比1∶20、孵育温度37℃及孵育时间3h。
　　2.ASMA对OVA的佐剂作用
　　采用模式抗原OVA，以AJS为对照，通过检测免疫小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类效价，从降低抗原及AJS用量角度评价了ASMA对OVA的佐剂活性。结果表明:ASMA显著提高OVA低剂量（2.5μg)受免小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的抗体滴度(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，且OVA低剂量联合ASMA高剂量(10μg)免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度显著高于OVA高剂量(25μg)单独免疫组及OVA低剂量(2.5μg)联合AJS免疫(100μg)，说明了ASMA可降低OVA抗原和AJS的使用剂量。
　　3.ASMA对猪O型口蹄疫灭活疫苗的佐剂作用及其机制
　　以ICR小鼠为实验动物，以AJS为对照，灭活猪O型口蹄疫病毒(Inactivated type-Ofoot-and-mouth disease virus，IFMDV)单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，收集血液，分离血清，制备脾细胞悬液。采用间接ELISA检测受免小鼠血清中特异性IgG总抗体及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的效价;MTT法测定Con A和LPS刺激受免小鼠脾细胞增殖反应及NK细胞活性;RT-PCR法检测受免小鼠脾细胞中细胞因子和转录因子mRNA表达水平。结果表明:ASMA不仅能显著提高IFMDV受免小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(P＜0.001)，而且可增强Con A和LPS刺激的FMDV受免小鼠脾细胞增殖反应(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)以及受免小鼠脾脏NK细胞对靶细胞的杀伤活性(P＜0.05或P＜0.01)，上调脾细胞Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，转录因子T-bet、STAT4和Th2型细胞因子IL-4、IL-10，转录因子GATA3、STAT6的基因表达水平(P＜0.001)。
　　以ICR小鼠为实验动物，以QuilA和AJS为对照，IFMDV单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射致敏小鼠，第五天进行激发，12 h后测量小鼠足垫的肿胀情况。结果表明:ASMA各剂量组均可显著促进小鼠对猪口蹄疫病毒(FMDV)诱导的DTH反应，诱导强烈的特异性细胞免疫应答。
　　以Balb/c小鼠为实验动物，猪O型口蹄疫商品油佐剂疫苗(CFMDV)和AJS为对照，IFMDV单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，制备腹股沟淋巴结和脾细胞悬液。使用流式细胞术检测了小鼠脾和淋巴结细胞VP1特异性CD4/CD8 T细胞细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10)表达情况。结果表明:在脾脏和淋巴结中，ASMA组分泌细胞因子的CD4/CD8+T细胞都高于水相疫苗及油苗对照组相，能够诱导Th1/Th2型CD4+T细胞免疫应答以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答。
　　上述实验结果说明:ASMA能增强小鼠对IFMDV的体液免疫和细胞免疫反应，对口蹄疫疫苗具有显著的佐剂作用
　　4.ASMA对猪瘟弱毒活疫苗的佐剂作用
　　以ICR小鼠为实验动物，Quil A和AJS为对照，猪瘟弱毒活疫苗(兔源，Classical swine fever livevaccine(Rabbit Origin)，SFVR)单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射免疫小鼠，间隔两周加强免疫。二免后14天，处死小鼠，收集血液，分离血清，制备脾细胞悬液。采用间接ELISA检测受免小鼠血清中猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)特异性IgG总抗体及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的效价;MTT法测定Con A和LPS刺激受免小鼠脾细胞增殖反应及NK细胞活性。结果表明:ASMA可显著提高受免小鼠血清中CSFV特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的抗体滴度(P＜0.01或P＜0.001)。ASMA可显著增强受免小鼠脾脏内NK细胞对靶细胞的杀伤活性(P＜0.05或P＜0.01)。
　　以ICR小鼠为实验动物，以Quil A和AJS为对照，SFVR单独或联合不同剂量的ASMA皮下注射致敏小鼠，第五天进行激发，12 h后测量小鼠足垫的肿胀情况。结果表明:ASMA可显著促进小鼠对SFVR诱导的DTH反应，诱导强烈的特异性细胞免疫应答。可见，ASMA能显著SFVR受免小鼠体液免疫和细胞免疫应答反应，对猪瘟弱毒活疫苗有显著的佐剂作用。
　　综上所述，ASMA对OVA、猪口蹄疫灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗均具有显著的佐剂作用，是一种理想的疫苗候选佐剂。研究结果为ASMA作为疫苗佐剂进一步开展临床试验奠定了基础。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

第一章 ISCOMATRIX佐剂研究进展

1．组成成分

2．佐剂的制备和表征

3．作用机制

4．临床进展

5．小结

第二章 合欢皮皂苷化学成分及药理作用研究进展

1．化学成分

2．药理作用

2．1 抗肿瘤作用

2．2 免疫调节作用

2．3 抗生育作用

2．4 抗抑郁作用

3．结语

第三章 ASMA制备工艺的研究

1．材料和仪器

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试药物

1．4 实验动物

2．方法

2．1 正交试验

2．2 AsMA中合欢皮皂苷含量的测定

2．3 佐剂活性评价

2．4 统计学分析

3．结果

3．1 OVA特异性抗体效价正交试验结果

3．2 ASMA物理结构

4．讨论与小结

第四章 ASMA对OVA的佐剂作用研究

1．材料和仪器

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试药物

1．4 实验动物

2．方法

2．1 免疫程序

2．2 间接ELISA测定血清中OVA特性IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度

2．3 统计学分析

3．结果

3．1 ASMA对受免小鼠血清中OVA特异性IgG抗体效价的影响

3．2 ASMA对受免小鼠血清中OVA特异性IgG1抗体效价的影响

3．3 ASMA对受免小鼠血清中OVA特异性IgG2a抗体效价的影响

3．4 ASMA对受免小鼠血清中OVA特异性IgG2b抗体效价的影响

4．讨论与小结

第五章 ASMA对猪O型口蹄疫灭活疫苗的佐剂作用及其机制

1 材料和仪器

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 细胞株

1．4 供试药物

1．5 实验动物

2．方法

2．1 免疫程序

2．2 对受免小鼠血清中特异性抗体效价的影响

2．3 脾脏和淋巴结单细胞悬液制备

2．4 脾细胞增殖实验

2．5 NK细胞活性测定

2．6 受免小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达水平测定

2．7 ASMA对FMDV诱导的DTH反应的影响

2．8 对FMDV受免小鼠FMDV-VP1特异性T细胞细胞因子反应的影响

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 ASMA对受免小鼠血清中FMDV特异性抗体及其亚类的影响

3．2 ASMA对受免小鼠脾细胞增殖反应的影响

3．3 ASMA对受免小鼠NK细胞杀伤活性的影响

3．4 ASMA对受免小鼠脾细胞因子和转录因子基因表达影响

3．5 ASMA对FMDV诱导的DTH反应的影响

3．6 对FMDV受免小鼠脾脏、淋巴结VP1特异性T细胞细胞因子反应的影响

4．讨论

5 小结

第六章 ASMA对猪瘟弱毒疫苗的免疫佐剂作用

1 材料和仪器

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 细胞株

1．4 供试药物

1．5 实验动物

2．方法

2．1 免疫程序

2．2 间接ELISA测定血清中CSFV特异性IgG及其亚类抗体效价

2．3 NK细胞活性测定

2．4 ASMA对CSFV诱导的DTH反应的影响

2．5 统计学分析

3 结果

3．1 ASMA对受免小鼠血清中CSFV特异性抗体及其亚类的影响

3．2 ASMA对受免小鼠NK细胞杀伤活性的影响

3．3 ASMA对CSFV诱导的DTH反应的影响

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

致谢