典型三苯甲烷还原酶的细胞表面展示及新型双功能染料还原酶的挖掘和底物识别机制研究

摘要

印染废水水量大、水温高、成分复杂等特性对现有的生物处理方法提出了严峻的挑战，因此寻找高效、稳定、低成本、广谱的印染废水处理方案成为了当务之急。本研究旨在通过构建染料高效降解酶的表面展示系统，既可以解决染料跨膜运输的难题，又可以降低废水处理成本，为染料降解酶的实际应用提供理论基础。同时本研究通过基因组挖掘获得了一个可以同时降解三苯甲烷和偶氮染料的还原酶，并部分阐明了其底物识别机制，对具有底物广谱性的染料降解酶类的改造具有重要意义。论文主要研究结果如下:
　　1)重组三苯甲烷还原酶CsTMR为同源二聚体，最适pH和温度分别为8.5和55℃，在45℃以下处理半小时后保持稳定，在5.0-10.0的pH范围内处理后可以保持其初始活性的50％以上。总体而言，该酶活性和稳定性较好，适合作为固定化或表面展示的对象来为染料废水的降解研究提供新的思路。
　　2)以来自Pseudomonas borealis的冰晶核蛋白N端(InaPb-N)作为锚定蛋白，构建CsTMR大肠杆菌表面展示系统。约有85％的外源蛋白被成功展示在大肠肝菌外膜上，表面展示CsTMR对孔雀石绿的脱色速率达到了640μtmol min-1 g-1DWC。表面展示酶的稳定性比游离纯酶显著提高，特别是长期稳定性。在我们进一步尝试构建辅酶再生体系，利用InaPB-N介导的葡萄糖脱氢酶DS255表面展示系统时，在胞外检测不到GDH活性，说明DS255没有被成功展示。
　　3)利用cotG作为分子载体构建枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统，将CsTMR和DS255成功展示在芽孢表面。与纯酶相比，两种表面展示的蛋白对pH和温度的耐受范围更广，且具有更好的稳定性。利用表面展示的CsTMR和DS255的芽孢，作为全细胞催化剂构建辅酶再生体系，根据不同的参数得出整个体系需要较高比例的芽孢展示DS255才能够满足CsTMR对于NADH的需求，从而达到较高的降解速率。
　　4)以CsTMR氨基酸序列为探针，通过数据库挖掘，从Geobacillusthermoglucosidasius C56-YS93的得到一个可能编码三苯甲烷还原酶的基因，根据其底物特异性将其命名为GtAZR。重组GtAZR在pH5.5和40℃条件下具有最大活性，在低于65℃的温度下保持稳定，同时它也具有较广的pH耐受范围。该酶对有机溶剂有非常高的耐受性。此外，GtAZR底物谱较广，能同时降解三苯甲烷和偶氮类染料。GtZAR强大的稳定性和底物广谱性使它在处理实际混合染料废水中有着极好的应用前景。
　　5)通过同源建模、分子对接、分子动力学模拟和定点突变实验，对CsTMR和GtAZR的底物识别机制进行了初步探索。研究结果显示，GtAZR的第79、80和148位氨基酸残基可能参与其对甲基红的识别，而CsTMR的146位氨基酸可能与其对孔雀石绿的识别有关。本研究从结构的角度部分阐明了GtAZR的底物识别机制，为染料降解酶类底物谱的改造提供了新的思路。

目录

声明

致谢

摘要

缩写表

第1章 绪论

1．1 染料废水的处理方法

1．1．1 物理法

1．1．2 化学法

1．1．3 生物法

1．2 微生物表面展示技术

1．2．1 微生物表面展示系统构成

1．2．2 微生物细胞表面展示系统

1．3 选题背景和研究内容

第2章 三苯甲烷还原酶异源表达及酶学性质研究

2．1 材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 化学试剂和分子生物学试剂

2．1．3 培养基和缓冲液

2．1．4 主要仪器和设备

2．2 方法

2．2．1 cstmr基因密码子优化及全合成

2．2．2 CsTMR的表达载体构建

2．2．3 重组CsTMR的诱导表达

2．2．4 亲和层析纯化重组CsTMR

2．2．5 SDS-PAGE凝胶电泳

2．2．6 凝胶过滤层析

2．2．7 蛋白浓度测定

2．2．8 重组CsTMR性质的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 cstmr基因的密码子优化

2．3．2 重组CsTMR表达质粒的构建

2．3．3 重组CsTMR的诱导表达和纯化

2．3．4 重组CsTMR的最适反应温度和温度稳定性

2．3．5 重组CsTMR的最适反应pH和pH稳定性

2．3．6 重组CsTMR的底物谱

2．3．7 金属离子和EDTA对重组CsTMR活性的影响

2．3．8 有机溶剂对重组CsTMR稳定性的影响

2．4 小结

第3章 三苯甲烷还原酶的大肠杆菌表面展示

3．1 材料

3．1．1 菌种和质粒

3．1．2 化学试剂和分子生物学试剂

3．1．3 培养基和缓冲液

3．1．4 主要仪器和设备

3．2 方法

3．2．1 截断冰核蛋白基因密码子优化及全合成

3．2．2 大肠杆菌表面展示载体构建

3．2．3 表面展示CsTMR的诱导表达

3．2．4 细胞组分分级分离

3．2．5 SDS-PAGE凝胶电泳

3．2．6 蛋白印迹

3．2．7 蛋白酶处理全细胞

3．2．8 表面展示CsTMR性质的研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 inaPb-N基因的密码子优化

3．3．2 大肠杆菌表面展示CsTMR载体的构建

3．3．3 表面展示工程菌的诱导表达及验证

3．3．4 表面展示CsTMR的最适反应温度和温度稳定性

3．3．5 表面展示CsTMR的最适反应pH和pH稳定性

3．3．6 重组表面展示CsTMR的底物谱

3．3．7 稳态动力学研究

3．3．8 表面展示CsTMR的长期稳定性

3．3．9 表面展示工程菌和其他高效微生物对孔雀石绿降解率的比较

3．4 小结

第4章 三苯甲烷还原酶的芽孢表面展示

4．1 材料

4．1．1 菌种和质粒

4．1．2 化学试剂和分子生物学试剂

4．1．3 培养基和缓冲液

4．1．4 主要仪器和设备

4．2 方法

4．2．1 芽孢展示载体构建

4．2．2 枯草芽孢杆菌转化及筛选

4．2．3 重组芽孢的制备

4．2．4 蛋白酶处理全细胞

4．2．5 表面展示CsTMR性质的研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 芽孢表面展示载体的构建

4．3．2 诱导产孢及芽孢展示验证

4．3．3 芽孢表面展示三苯甲烷还原酶的酶学性质

4．3．4 芽孢表面展示葡萄糖脱氢酶的酶学性质

4．3．5 染料全细胞脱色自循环系统

4．4 小结

第5章 新型双功能染料降解酶的挖掘及功能研究

5．1 材料

5．1．1 菌种和质粒

5．1．2 化学试剂和分子生物学试剂

5．1．3 培养基和缓冲液

5．1．4 主要仪器和设备

5．2 方法

5．2．1 新型染料降解酶基因密码子优化及全合成

5．2．2 GtAZR的表达载体构建

5．2．3 GtAZR的诱导表达

5．2．4 亲和层析纯化重组三苯甲烷还原酶

5．2．5 SDS-PAGE凝胶电泳

5．2．6 活性电泳

5．2．7 凝胶过滤层析

5．2．8 蛋白浓度测定

5．2．9 重组GtAZR性质的研究

5．3 结果与讨论

5．3．1 GtAZR序列分析

5．3．2 gtazr基因的密码子优化

5．3．3 重组GtAZR质粒的构建

5．3．4 重组GtAZR的诱导表达和纯化

5．3．5 重组GtAZR的最适反应温度和温度稳定性

5．3．6 重组GtAZR的最适反应pH和pH稳定性

5．3．7 重组GtAZR的底物谱

5．3．8 金属离子对重组酶活性的影响

5．3．9 有机溶剂对重组酶稳定性的影响

5．3．10 稳态动力学研究

5．4 小结

第6章 三苯甲烷还原酶底物识别机制研究

6．1 材料

6．1．1 菌种和质粒

6．1．2 化学试剂和分子生物学试剂

6．1．3 培养基和缓冲液

6．1．4 主要仪器和设备

6．2 方法

6．2．1 同源建模

6．2．2 分子对接

6．2．3 分子动力学模拟及分析

6．2．4 突变体构建

6．2．5 突变体表达、纯化及活性测定

6．3 结果和讨论

6．3．1 同源建模模型评价

6．3．2 分子对接

6．3．3 分子动力学模拟

6．3．4 突变体构建

6．3．5 突变体表达、纯化及活性测定

6．3．6 推测的底物识别机制

6．4 小结

结论与展望

1、结论

2、创新点

3、展望

参考文献

附录

攻博期间发表的论文