冷鲜鸡全产业链弯曲菌生态分布特征及其冷藏条件下失活模型的建立

摘要

弯曲菌属（Campylobacter spp.）是近四十年来人类公共健康问题的重要病原菌，可导致人类细菌性腹泻，其中空肠弯曲菌（C.jejuni）和结肠弯曲菌(C.coli)感染最常见。家禽是弯曲菌属的主要宿主，禽源产品也成为弯曲菌感染人类的主要途径。因此，了解冷鲜鸡全产业链弯曲菌属生态分布特征对控制弯曲菌的污染风险极为重要。本研究在弯曲菌分子鉴定和分离培养的基础上，开展冷鲜鸡全产业链“养-宰-售”各环节中该菌的生态分布特征和多位点序列分型(MLST)研究，结合冷藏条件下弯曲菌失活动力学模型，以及有机酸对鸡肉中的空肠弯曲菌抑菌效果分析，为在冷鲜鸡全产业链中该菌的控制提供数据和技术支撑。
　　1.弯曲菌分子检测方法的建立及增首条件优化
　　本研究建立了空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR方法以及空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法。多重PCR方法检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌特异性好，检测C.jejuni，C.coli灵敏度为分别为2.2×103CFU/mL和3.8×104CFU/mL。针对空肠弯曲的mapA基因建立了荧光定量PCR方法，该方法特异、快速，检测下限为102CFU/mL，以细菌点板计数后抽提的DNA为标准品建立了标准曲线，标准曲线呈良好的线性关系，R2=0.98，斜率为-3.5441，扩增效率为97.6％，可用于临床样品的细菌数检测。
　　2.弯曲菌冷鲜鸡全产业链中的生态分布特征
　　对浙江省内多个地区家禽养殖场、家禽屠宰环境及市售鸡肉等样品进行多重PCR检测，结果表明，667份样品中，空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检出率为分别为32.1％和3.4％;两种弯曲菌在养殖场、家禽屠宰场和市场的检出率分别为39.8％(74/186)、25％(79/316)和56.1％(69/123);农贸市场样品中弯曲菌的检出率比超市样高(61.7％ vs11.9％)。通过对家禽屠宰过程中空肠弯曲菌的动态变化监测，屠宰环节中的卸货间、净膛间、喷淋间的家禽携带空肠弯曲菌较高，大于4.0log10CFU，环境中的包装间地面、储物间和冷冻库货筐带菌量多。消毒预冷环节从开始屠宰的两个小时开始可以检测到空肠弯曲菌，并且细菌数量随着屠宰时间的延长而增加，屠宰开始后6h时达到最高，其中预冷池二中空肠弯曲菌浓度可达5.36log10CFU/mL，与鸡胴体中细菌携带率变化一致。
　　3.空肠弯曲菌分离株的多位点序列分型
　　本研究对来自养鸡场、屠宰场以及市场出售冷鲜鸡的空肠弯曲菌分离株进行多位点序列分型，79株空肠弯曲菌分离株共有30个不同序列型，其中有13个是新发现的序列型(43.3％)，包含50株分离株。等位基因值数量最多的是pgm(15)，最少的为uncA(8)。79株分离株中共有10株有新的等位基因值。所有管家基因中新的等位基因值分别有:aspA（1个），glnA（1个），glyA（2个），pgm（2个），glyA、 tkt和uncA没有新的等位基因值。不同来源空肠弯曲菌分离株的序列型复杂性存在一定的差异，养殖场样品的43个菌株有7种序列型，屠宰场样品7株中有4种序列型，市场样品的29株中有21种序列型，其中ST298存在于养殖、屠宰环节，ST7922存在于屠宰和市场环节中。
　　4.冷藏条件下弯曲菌失活动力学模型
　　通过鸡肉中的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在6℃条件下30d内失活规律研究，拟合得到了两种菌在6℃条件下log-logistic的一级生长预测模型。在4℃、8℃和16℃条件下贮藏8d内，log-logistic模型对空肠弯曲菌的失活规律依然有较好的拟合性。醋酸、乙酸和柠檬酸三种减菌剂来模拟消毒环节，用醋酸浸泡空肠弯曲菌污染的鸡肉最多可减菌70％。
　　综上所述，本研究建立了空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR方法以及空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法，对空肠弯曲菌分离株进行了多位点序列分型分析，建立了冷藏条件下空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的一级失活动力学模型，为进一步开展冷鲜鸡全产业链弯曲菌污染监测以及危害控制点分析和控制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 空肠弯曲菌研究进展

1 前言

2 空肠弯曲菌生物学特性

3 空肠弯曲菌分型方法

4 空肠弯曲菌的分离鉴定

5 空肠弯曲菌流行病学特征

6 防治措施

第二部分 试验部分

第二章 冷鲜鸡全产业链弯曲菌生态分布特征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 空肠弯曲菌分离株的多位点序列分型

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 冷藏条件下鸡肉中弯曲菌失活动力学特征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢