耐辐射奇球菌群体感应系统及其在菌体氧化胁迫抗性中功能的研究

摘要

耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans，简称DR)属于奇球菌属，该属细菌通常对极端环境，如电离辐射、紫外照射、干燥和氧化剂等，具有无可比拟的超强抗性。多年来，耐辐射奇球菌已成为人们研究微生物在极端环境压力下抗性的模式生物之一。然而在菌群水平上，耐辐射奇球菌是如何应对极端环境压力的机制尚不清楚。本研究利用生化和分子生物学等手段研究了耐辐射奇球菌群体感应(Quorum Sensing，QS)系统，研究了其作为菌体细胞间信号通讯途径参与菌群水平氧化应激反应的功能与作用机制。
　　首先，发现DR菌能够合成群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)，研究鉴定了耐辐射奇球菌特殊的DqsIR群体感应系统并发现其对菌体的氧化胁迫抗性具有重要作用。DR菌具有不同于其他微生物中LuxI、LuxM等的AHL合成酶DqsI-1和DqsI-2;在没有氧化压力条件下，AHL水平由于群体感应信号降解酶(quorum quenching enzyme)的作用而被抑制，而在氧化胁迫下，DqsI-1和DqsI-2表达上调导致AHL的积累，表现为一种特殊的氧化条件依赖的群体感应作用;DqsIR群体感应系统的AHL合成酶和AHL降解酶的表达呈现出一种动态模式，从而控制菌体在有无氧化压力条件下AHL信号的水平;AHLs通过与调控因子DqsR相互作用调节了抗逆基因的转录水平，参与了耐辐射奇球菌的氧化压力抗性作用。与野生菌株相比，dqsI缺失突变株(DMDqsI)和dqsR缺失突变株(MDqsR)都对氧化压力更加敏感。外源添加AHL信号分子可以完全补偿DMDqsI的氧化抗性表型。RNA-seq转录组数据表明，MDqsR中许多参与损伤响应、DNA修复过程等的基因转录水平都发生了改变。因此，DqsIR介导的群体感应系统参与了耐辐射奇球菌应对氧化压力的抗性机制，并且在奇球菌属细菌中可能是保守存在的。
　　其次，自诱导物-2（AI-2）作为可以同时介导细菌种内和种间群体感应的信号分子，对参与调节各种细菌的行为起着重要作用。在本研究中，我们通过构建AI-2合成酶LuxS同源物基因的缺失突变株(DR△LuxS)，结合生存率表型实验和基因转录分析实验探究了AI-2信号在DR菌抗性中的作用。突变株DR△LuxS不能合成AI-2。与野生型菌株相比，DR△LuxS对伽马辐射和H2O2更加敏感;但向DR△LuxS菌株中添加野生菌株的培养上清液可以完全补偿其抗性表型;在正常或氧化应激条件下，突变菌株中活性氧自由基的水平都高于野生株。实时定量PCR结果显示一些抗性相关基因的转录水平在DR△luxS中下降，其中包括过氧化氢酶、胞外核酸酶、DPS-1和ABC转运蛋白等，表明AI-2参与调控了耐辐射奇球菌部分压力胁迫响应相关基因。因此，AI-2信号对耐辐射奇球菌极端环境抗性具有一定的贡献。
　　本论文研究了耐辐射奇球菌群体感应系统及其对菌体氧化胁迫抗性基因的调控作用，研究结果为从群体感应水平上揭示耐辐射奇球菌应对氧化胁迫的抗性作用机制和深入了解菌体极端环境抗性机理提供了基础。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

主要缩略词

1 文献综述

1．1 耐辐射奇球菌的研究进展

1．1．1 耐辐射奇球菌细胞壁的组成结构

1．1．2 耐辐射奇球菌基因组的组成和结构特征

1．1．3 耐辐射奇球菌高效的DNA修复途径

1．1．4 耐辐射奇球菌的抗氧化机制

1．1．5 耐辐射奇球菌的细胞清除(Cell cleansing)途径

1．1．6 耐辐射奇球菌中与抗性相关的转录调控因子

1．2 细菌群体感应机制的研究进展

1．2．1 革兰氏阴性细菌的群体感应系统

1．2．2 革兰氏阳性细菌的群体感应系统

1．2．3 细菌种间的群体感应系统

1．2．4 多种群体感应系统的共同存在

1．3 群体感应淬灭系统

1．4 群体感应信号分子检测技术

1．4．1 AHL分子的检测

1．4．2 AI-2分子的检测

2 耐辐射奇球菌中AHL信号分子的检测及其合成酶的鉴定

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验菌种和质粒

2．2．2 主要试剂和仪器

2．2．3 耐辐射奇球菌上清液的制备与AHL分子的报告菌株检测

2．2．4 DqsI表达菌株和基因缺失突变株的构建

2．2．5 AHL的液质联用分析

2．2．6 体外纯化DqsI-1和DqsI-2及其AHL合成活性的测定

2．2．7 实时定量PCR

2．2．8 Western blot

2．2．9 薄层层析法分析脂类组成

2．3 结果与分析

2．3．1 耐辐射奇球菌中AHL分子的检测

2．3．2 耐辐射奇球菌中AHL合成酶的鉴定

2．3．3 LC-MS分析AHL合成酶在大肠杆菌中表达的产物

2．3．4 耐辐射奇球菌中AHL水平受氧化压力的诱导与群体感应降解酶的抑制

2．3．5 氧化条件下AHL合成酶和降解酶表达水平的动态变化

2．3．6 奇球菌属其他细菌中AHL水平的检测

2．4 讨论

2．5 小结

3 耐辐射奇球菌群体感应调控因子DqsR蛋白的功能研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验菌种和质粒

3．2．2 dqsR基因缺失突变株和补偿株的构建

3．2．3 pdqsR-lacZ融合质粒的构建及β-半乳糖苷酶的活性分析

3．2．4 RNA-seq及数据分析

3．2．5 表达与纯化DqsR蛋白

3．2．6 凝胶过滤色谱层析

3．2．7 凝胶迁移(EMSA)

3．3 结果与分析

3．3．1 群体感应调控蛋白的生物信息学分析

3．3．2 dr_0987基因启动子的活性分析

3．3．3 耐辐射奇球菌中DqsR蛋白功能的鉴定

3．3．4 缺失dqsR降低了耐辐射奇球菌对电离辐射和H2O2的抗性

3．3．5 RNA-seq数据分析

3．3．6 差异表达基因分析

3．3．7 DqsR对氧化响应与修复相关基因的调控

3．3．8 预测DqsR结合DNA的序列

3．3．9 DqsR对基因启动子的结合作用

3．3．10 DqsR在多种AHL存在条件下聚合状态的探讨

3．4 讨论

3．5 小结

4 Autoinducer-2信号参与调控耐辐射奇球菌压力胁迫相关的基因表达

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验菌种和质粒

4．2．2 化学试剂和实验仪器

4．2．3 生物信息学分析

4．2．4 dr_2387基因缺失突变株的构建

4．2．5 耐辐射奇球菌培养物上清液的制备与AI-2分子的检测

4．2．6 生长曲线的测定

4．2．7 菌体辐射和氧化抗性的测定

4．2．8 细胞活性氧ROS的测定

4．2．9 过氧化氢酶及超氧化物歧化酶活性的测定

4．2．10 实时定量PCR

4．3 结果与讨论

4．3．1 耐辐射奇球菌中LuxS同源物的生物信息学分析

4．3．2 dr_2387缺失突变株的鉴定

4．3．3 敲除dr_2387对耐辐射奇球菌生长的影响

4．3．4 DR△LuxS突变株中AI-2的活性分析

4．3．5 AI-2对耐辐射奇球菌抗性的影响

4．3．6 野生株与突变株细胞内ROS水平和抗氧化酶活性的比较

4．3．7 DR△LuxS中部分胁迫相关的基因转录水平变化分析

4．4小结

5 总结与展望

参考文献

附录

博士期间发表的论文