耐辐射奇球菌DNA末端切割过程的结构与功能学研究

摘要

耐辐射奇球菌作为迄今为止发现的最具辐射抗性的生物之一，其强大的DNA损伤修复能力一直被作为研究的焦点。同源重组是细菌中修复DNA双链断裂的重要途径。细菌的同源重组主要分为RecBCD和RecFOR两个系统。耐辐射奇球菌天生不具备RecBCD途径，只含RecFOR系统，因而耐辐射奇球菌成为研究RecFOR系统最理想的模式菌种。同源重组开始阶段有一个重要的过程，即通过一些核酸酶/解旋酶处理损伤的DNA末端，形成3'单链DNA末端，继而入侵同源链，造成链交换发生同源重组。此过程在RecBCD系统中已经研究得比较透彻，而在RecFOR系统中却不甚明确。
　　目前普遍认为，核酸酶RecJ、解旋酶RecQ和单链结合蛋白SSB参与了RecFOR系统中的这个过程。为了研究该过程的分子机制，本文解析了drRecJ与底物DNA复合体结构，drRecJ与产物(dTMP)复合体结构，以及SSB C末端肽段与drRecJ的复合体结构，并进行了相应的生化实验验证。drRecJ利用双金属离子催化机制，其底物ssDNA末端碱基与倒数第二个碱基形成180度U形拐角，有利于活性位点对磷酸骨架的固定及打断。活性位点的5'磷酸结合口袋保证了drRecJ对5，端底物ssDNA的识别，以及5'-3'外切酶方向的特异性。位于DNA进口处的三个α螺旋构成的“门”，保证了drRecJ只能容纳单链DNA进入活性位点。活性中心区域DNA结合通道以及OB结构域多个残基对DNA的稳定结合，保证了DNA的高效运输以及切割的连续性。SSB C末端肽段结合在drRecJC端结构域的一个疏水口袋里，解释了SSB对RecJ的招募以及活性加强机制。RecQ的加入，促进了drRecJ对带有3'overhang双链DNA的切割，完美地演绎了RecJ，SSB和RecQ三者参与的RecFOR系统对任何形式DNA末端切割的过程。
　　另一方面，本文发现drRecJ的C端结构域还能与HerA互作。HerA，作为一个ATP酶/DNA运输酶，与另一个核酸酶，NurA，一起被认为参与了古菌同源重组系统的DNA切割过程。本文研究了耐辐射奇球菌HerA和NurA蛋白的生化及遗传学特征。我们发现，和古菌同源蛋白类似，drHerA具备ATP酶活性，而drNurA则表现出Mn依赖性的5'-3'单链/双链DNA外切/内切酶活性。两蛋白各自的活性均能被对方激活。并且，drHerA的N端HAS结构域被鉴定出来能与drNurA直接互作。herA，nurA敲除菌株均表现出生长变快（尤其在37℃高温下），对丝裂霉素C抗性增强的现象，与recJ突变株的生长变慢以及丝裂霉素C极其敏感正好相反。体外生化实验显示， HerA可以增强RecJ活性，然而NurA的加入可以抑制这种增强。结合表型结果，我们认为，HerA，NurA这类古菌普遍存在的DNA末端处理蛋白出现在耐辐射球菌中，可能对耐辐射奇球菌的RecFOR系统有一种调节作用，具体的调节机制还有待未来进一步探索。

目录

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论文说明

致谢

摘要

主要缩略词

第1章 文献综述

1．1 耐辐射球菌DNA损伤修复机制的研究进展

1．1．1 耐辐射奇球菌概述

1．1．2 耐辐射奇球菌辐射抗性机制

1．1．3 耐辐射奇球菌特有的修复相关蛋白及机制

1．2 RecJ／DHH家族生物学功能研究进展

1．2．1 RecJ／DHH家族概述

1．2．2 RecJ蛋白的研究进展

1．2．3 RecJ-like蛋白的研究进展

1．2．4 其它RecJ／DHH家族成员的研究进展

1．3 HerA-NurA复合体生物学功能研究进展

1．3．1 HerA蛋白研究进展

1．3．2 NurA蛋白研究进展

1．3．3 HerA-NurA复合体的研究进展

第2章 耐辐射奇球菌RecJ蛋白整体结构及各结构域功能的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 设备与菌体培养

2．2．2 补偿菌株与蛋白表达载体的构建

2．2．3 RecJ全长蛋白及其截断蛋白的表达与纯化

2．2．4 SDS-PAGE银染方法

2．2．5 RecJ结晶实验

2．2．6 晶体X射线衍射数据的收集和分析

2．2．7 Western blotting分析RecJ全长蛋白及其截断蛋白在体内的表达情况

2．2．8 生存率的测定

2．2．9 生长曲线的测定

2．2．10 RecJ全长蛋白及其截断蛋白的核酸酶活性实验

2．2．11 RecJ全长蛋白及其截断蛋白的DNA结合实验

2．3 结果与讨论

2．3．1 drRecJ全长蛋白的纯化

2．3．2 drRecJ-dTMP复合体的结晶及结构解析

2．3．3 drRecJ全长蛋白和各结构域的结构总览

2．3．4 drRecJ结构和生化水平的金属偏好性研究

2．3．5 drRecJ全长蛋白及其截断体对recJ突变株补偿效果分析

2．3．6 drRecJ各截断体的纯化

2．3．7 drRecJ全长蛋白及其截断体的DNA酶切效率比较

2．3．8 drRecJ全长蛋白及其截断体的DNA结合能力比较

2．4 本章小结

第3章 RecJ-DNA复合物晶体结构的解析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 蛋白纯化与结晶

3．2．2 drRecJ全长蛋白及其各点突变蛋白的核酸酶活性实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 drRecJ的底物分析

3．3．2 drRecJ催化中心点突变蛋白活性比较及金属离子结合情况分析

3．3．3 drRecJ-DNA复合体结构概况

3．3．4 drRecJ DNA结合通道的结构分析

3．3．5 drRecJ OB fold特殊的DNA结合方式

3．3．6 从结构上分析drRecJ的催化机制

3．3．7 从结构上分析DHH家族subfamily1和subfamily2底物的区别

3．4 本章小结

第4章 RecJ-SSB-Ct复合物晶体结构的解析以及末端处理过程模拟

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 体内Co-IP鉴定互作蛋白

4．2．2 表达载体的构建

4．2．3 蛋白纯化与结晶

4．2．4 核酸酶活性实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 drRecJ互作蛋白的获得与鉴定

4．3．2 SSB-Ct结合位点位于drRecJ的C端结构域

4．3．3 SSB-Ct与drRecJ的互作是其激活RecJ活性所必须

4．3．4 SSB与RecQ激活drRecJ的可能机制

4．4 本章小结

第5章 HerA-NurA复合体生化功能的研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 设备与菌体培养

5．2．2 herA，nurA和nurA-herA突变菌株的构建

5．2．3 补偿菌株与蛋白表达载体的构建

5．2．4 HerA蛋白与NurA蛋白的纯化

5．2．5 酵母双杂交实验

5．2．6 分析凝胶过滤实验

5．2．7 Pull down实验

5．2．8 HerA ATPase活性分析

5．2．9 核酸酶活性分析

5．2．10 Western blotting分析补偿菌株是否构建成功

5．2．11 生存率的测定

5．2．12 生长曲线的测定

5．2．13 重组率的测定

5．2．14 荧光共聚焦对HerA和NurA蛋白体内的定位研究

5．3 结果与讨论

5．3．1 nurA，herA生物信息学分析

5．3．2 drNurA和drHerA互作的验证

5．3．3 HerA ATPase活性的研究

5．3．4 drNurA酶切活性的研究

5．3．5 nurA，herA和nurA／herA基因敲除的验证

5．3．6 nurA，herA和nurA／herA突变株的生长情况

5．3．7 nurA，herA和nurA／herA突变株的生存率变化

5．3．8 nurA，herA和nurA／herA突变株的重组率变化

5．3．9 NurA和HerA在体内的分布情况

5．4 本章小结

第6章 RecJ与HerA的互作以及与HerA-NurA复合体关系的研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 设备与菌体培养

6．2．2 蛋白纯化

6．2．3 Far Western blot检验RecJ和HerA的互作

6．2．4 Pull down实验检验RecJ和HerA的互作

6．2．5 DNA酶切实验和DNA结合实验

6．2．6 生存率的测定

6．3 结果讨论

6．3．1 drHerA的C端能和drRecJ的C端直接互作

6．3．2 drHerA能促进drRecJ的DNA酶切活性和结合活性

6．3．3 drNurA能抑制drHerA对drRecJ酶切和结合活性的激活作用

6．3．4 drNurA和drRecJ相悖的表型暗示着两者在体内有相左的功能

6．3．5 drRecJ和drNurA两条DNA resection途径的模式图

6．4 本章小结

总结与展望

附录

攻读博士学位期间发表的论文

参考文献