瘤胃甲烷减排中草药筛选及目标中草药的作用机制研究

摘要

减少反刍动物甲烷的排放对缓解温室效应和提高饲料利用率具有双重意义。中草药含有丰富的活性物质，是一种潜在的瘤胃甲烷抑制剂，可通过调控瘤胃微生物菌群提高饲料利用率并抑制甲烷产生。本研究首先利用体外模拟瘤胃发酵试验技术对百味中草药进行了筛选和验证;然后讨论了对抑制甲烷最有效的中草药，紫苏子（Perilla Frutescens Seed，PFS）的剂型和剂量效应，并通过实时定量PCR、16S rDNA测序，探究了体外添加紫苏子提取物(Perilla Frutescens Seed Extracts，PFSE)对瘤胃微生物数量和种群的影响;最后以潮羊为模式动物，研究了在日粮中添加PFSE对湖羊消化功能、甲烷生成和瘤胃发酵的影响。
　　1抑制甲烷生成的中草药筛选和验证
　　1.1初步筛选
　　利用体外模拟瘤胃发酵试验技术，发酵体系为10ml，底物为0.1g精粗比是30∶70(DM)的玉米和羊草混合物。单因素试验设计，设置处理组100个，同时分别设置一个对照组和一个空白组，每个处理有3个重复。其中100个处理组分别为百味中草药的70％乙醇提取物，添加剂量为底物的4％(DM)，以40mg/ml的二甲基亚砜(DMSO)溶液的形式添加。对照组添加0.1ml DMSO，空白组无底物且不添加中草药提取物及DMSO，以扣除人工瘤胃液的自身产气量。体外发酵24h后测定产气量和甲烷产量。研究发现，有31味中草药降低甲烷产量达10％以上，其中降低甲烷产量最多的十味中草药依次是山竹皮(74.9％)、厚朴(60.1％)、乳香(45.4％)、苏木(44.8％)、五加皮(42.6％)、姜黄(42.6％)、蛇床子(38.8％)、远志(33.3％)、紫苏子(30.1％)和辛夷(29.0％)。
　　1.2发酵验证
　　对初筛中的31味中草药的降甲烷效果进行验证。同样利用体外模拟瘤胃发酵试验技术，发酵体系扩大为50ml，底物为0.5 g的玉米和羊草混合物，精粗比为30∶70(DM)。采用单因素实验设计，设置31个处理组，添加剂量仍然为底物的4％(DM)，对照组添加0.5ml DMSO，空白组和标准羊草组同筛选试验，每个处理有4个重复。体外发酵24 h后测定产气量、甲烷产量和其他瘤胃参数。在31味中草药提取物中，有10味产气量显著减少（P＜0.05），6味产气量显著增加（P＜0.05）;12味显著降低甲烷的产量（P＜0.05），只有桃仁提取物显著增加了甲烷的产量(P＜0.05)。除远志提取物之外，筛选试验中降低甲烷产量最多的10味中草药提取物在验证试验中被证实能够显著抑制甲烷生成（P＜0.05）。12味中草药提取物中，只有厚朴和酸枣仁在显著抑制甲烷生成的同时又没有减少产气量（P＞0.05）。在31味中草药提取物中，只有一味中草药提取物（辛夷）显著降低TVFA的浓度（P＜0.05），9味显著降低乙丙比（P＜0.05），其中有7味来自12味显著降低甲烷产量的中草药提取物。紫苏子在验证试验中降低甲烷产量的效果最好(63.6％)，因此作为目标提取物做进一步研究。
　　2紫苏子对瘤胃发酵和甲烷生成的影响及机制
　　不同剂型紫苏子，即提取物、普通粉（80目）和超微粉（600目），主要成分均为长链脂肪酸，其中PFSE中十八碳不饱和脂肪酸含量最高(675μg/mg)，约是普通粉（295μg/mg）的2倍，超微粉(118μg/mg)的3倍。体外模拟瘤胃发酵试验结果表明，与高剂量PFSE（2％，0.2mg/ml，DM）、普通粉和超微粉相比，添加低剂量的PFSE(1％，0.1mg/ml，DM)显著降低甲烷产量（P＜0.05）并显著增加有效产气量（P＜0.05），对其他发酵参数没有显著影响（P＞0.05）。
　　同样利用体外模拟瘤胃发酵试验技术，添加不同剂量PFSE，分别为底物干物质的0、1％、2％、3％和4％，体外发酵24h。结果表明，产气量、甲烷产量、TVFA、乙丙比以及干物质消化率均随PFSE剂量增加而线性降低，其中甲烷在添加量为1％时已下降显著(P＜0.05)，而产气量和TVFA分别是在2％和3％时下降显著（P＜0.05）。实时定量PCR结果表明PFSE剂量不影响总细菌和总甲烷菌数量，但降低原虫数量（P＜0.05）。PFSE的添加对羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和木聚糖酶的酶活性没有显著影响。
　　利用MiSeq高通量测序平台对对照组(0％，0mg/mL)、低剂量组(2％，0.2mg/mL)和高剂量组(4％，0.4mg/mL)样品微生物中细菌和古菌的16S rRNA基因进行扩增测序分析。(1) PFSE对细菌菌群的影响:不同处理组样品的细菌Chao1丰富度指数没有发生显著性变化（P＞0.05），Shannon多样性指数随PFSE添加量的增加显著降低。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门占细菌总序列数的89.6％以上。其中，变形菌门相对丰度随PFSE浓度的增加而线性增加(P＜0.05)，而拟杆菌门、纤维杆菌门、软壁菌门则线性降低（P＜0.05）。细菌OTUs数随PFSE剂量增加而降低。UniFrac分析表明添加0.4 mg/mL PFSE改变细菌群落，但0.2mg/mL添加浓度无影响。(2) PFSE对古菌菌群的影响:古菌Shannon指数随剂量增加而线性降低，但Chao1丰富度指数没有发生显著性变化。虽然qPCR结果显示古菌总数不受PFSE添加的影响，但测序数据显示Methanobrevibacter和Methanosphaera的相对丰度随PFSE剂量增加而增加，而Methanobacteriaceae的相对丰度随之降低。
　　微生物与甲烷产量、瘤胃发酵参数存在相关性，根据相关系数将瘤胃微生物分为5组。组Ⅰ与甲烷产量和总VFA呈正相关（P＜0.05，r＞0.607），包括Fibrobacter、Sphaerochaeta和其他八种未分类的细菌与未分类的Methano bacteriaceae。Clostridium、Pedobacter、Anaeroplasma、Paludibacter、Ruminococcus、Zymomonas、Luteimonas和其他七种未分类的细菌被划分为第2组，该组微生物与甲烷产量正相关，但与总VFA无关。与组Ⅰ相反，组Ⅲ中微生物与甲烷产量和总VFA都呈负相关（P＜0.05，r＞-0.598），包括Roseomonas、Selenomonas、Shuttleworthia、Pseudobutyrivibrio、Anaerovibrio、Ruminobacter、Succinivibrio、Methanosphaera和三种未分类的细菌。组Ⅳ微生物与甲烷产量呈负相关（P＜0.05，r＞-0.650），包括Methanobrevibacter和未分类的Sinobacteraceae。组Ⅴ由两种未分类的菌组成，其与甲烷产量和总VFA都无关。
　　3紫苏子提取物对湖羊甲烷生成影响的在体评定
　　采用反转实验设计，选取8只体况相近健康无病的成年公湖羊，设置对照组为基础日粮（300g精料和700g羊草），处理组为基础日粮上添加1％(DM)的PFSE。在湖羊日粮中添加1％(DM) PFSE，对湖羊的体重、干物质采食量、干物质消化率、粗蛋白消化率、中性洗涤纤维消化率和酸性洗涤纤维消化率均没有显著影响（P＞0.05），其中干物质消化率有降低的趋势(P=0.086);以干物质采食量为单位，与对照组相比处理组有降低瘤胃甲烷生成的趋势（P=0.075），而以可消化干物质和可消化纤维为单位，对照组和处理组瘤胃甲烷的生成量没有显著差异（P＞0.1）;添加PFSE对潮羊瘤胃的pH、NH3-N、乙酸、丙酸、丁酸、乙丙比和TVFA均没有显著影响（P＞0.1）。
　　综上所述，中草药具有良好的抑制瘤胃甲烷生成的效果，可作为潜在的甲烷抑制剂做进一步开发;低剂量的PFSE能抑制甲烷生成而不对饲料发酵造成负面影响;本研究发现一些细菌、甲烷菌与甲烷产生存在相关关系，进一步对这些微生物的深入研究有助于开发甲烷减排的新策略。

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表目录

英文缩略语一览表

摘要

引言

第一章 文献综述

第一节 瘤胃甲烷减排的研究进展

1 日粮调控

2 微生物干预

3 微生物机制及研究手段

第二节 植物源性物质对瘤胃甲烷生成的调控

1 植物精油

2 皂甙

3 单宁

第三节 本研究的目的、意义和内容

1 本研究的目的和意义

2 研究内容

3 技术路线

第二章 抑制甲烷生成的中草药筛选和验证

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三章 紫苏子对瘤胃发酵和甲烷生成的影响及机制

第一节 体外评价不同剂型紫苏子对瘤胃的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 体外评价不同剂量紫苏子提取物对瘤胃的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第四章 紫苏子提取物对湖羊甲烷生成及消化功能的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第五章 提示、创新点及研究展望

1 提示

2 创新点

3 研究展望

参考文献

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