产乙酸菌在草食动物消化道内的分布及其对甲烷排放的调节作用

摘要

本研究的目的在于通过研究奶牛、肉牛、湖羊的瘤胃、袋鼠的前胃、兔子盲肠和马的粪便中产乙酸菌的群落组成，探讨宿主种类、发酵模式、消化道部位等因素对产乙酸菌分布的影响;通过研究相同饲养环境和饲粮水平下不同日龄兔子盲肠内容物中产乙酸菌的群落组成，探讨宿主发育对产乙酸菌分布的影响;通过对牛、羊的瘤胃内容物，兔子盲肠内容物和马粪便中的产乙酸菌进行富集培养，探讨不同种类草食动物消化道内产乙酸菌氢利用能力的差异性;通过单独或联合添加外源产乙酸菌与酵母培养物，以及在抑制产甲烷菌活动的基础上添加产乙酸菌或间苯三酚，探讨通过强化瘤胃乙酸生成途径实现瘤胃发酵调控和甲烷减排的可行性。
　　1.不同种类宿主和消化道部位内产乙酸菌的群落组成特征:通过瘤胃瘘管技术采集6头泌乳后期奶牛、4只四月龄湖羊瘤胃内容物，通过屠宰技术采集6只六月龄日本大耳白兔盲肠内容物，通过蹲点取样的办法采集4匹四岁澳洲马的粪便，利用构建克隆文库的方法，并结合Genbank中澳大利亚袋鼠前胃和肉牛瘤胃中产乙酸菌ACS基因的序列信息，分析奶牛、肉牛、湖羊、袋鼠、兔子、马消化道内产乙酸菌群落组成的差异性。
　　2.发育阶段对草食动物消化道产乙酸菌群落的影响:通过屠宰技术，采集相同饲养环境下饲喂相同饲粮的1、2、4、6月龄新西兰大耳白兔的盲肠内容物，各6只，利用高通量测序和荧光定量PCR的方法分析不同日龄兔子盲肠内容物中产乙酸菌的组成情况。研究发现，兔子盲肠内有大量未知的产乙酸菌存在，4个月龄的兔子盲肠内容物中共检测到了6101个ACS OTU，4个月龄兔子盲肠内容物中产乙酸菌的数量无显著性差异。但产乙酸菌的群落组成会因日龄的增长发生改变，并且越来越趋向稳定。1和6月龄的兔子盲肠内容物中产乙酸菌的群落组成差异最大，有131个OTU丰度差异显著(P＜0.05)，而4和6月龄的兔盲肠内容物中产乙酸菌的丰度无显著差异，随着日龄增长，产乙酸菌群落组成的组间差异越来越小，预示着肠道产乙酸菌会在发育中趋于稳定和同质化。1和6月龄间差异显著的OTU分布在系统发生树上的不同位置，产乙酸菌种类的差异性可能与不同日龄兔子盲肠中乙酸生成途径不同有关。
　　3.草食动物消化道产乙酸菌富集培养物氢利用能力的研究:通过对奶牛、湖羊、兔子、马消化道内的产乙酸菌进行富集培养，研究了草食动物消化道产乙酸菌富集培养物利用合成气（氢气和二氧化碳）生成能量物质（乙酸、丙酸、丁酸）的能力。研究发现，马的粪便、兔盲肠内容物、奶牛和湖羊瘤胃内容物中的产乙酸菌经过富集培养后，在厌氧培养条件下菌体表现出相似的生长和氢利用特征，富集培养物均在培养48 h时达到最大菌体浓度，最主要的代谢产物为乙酸，同时也生成微量的丙酸、丁酸、异戊酸等副产物，但均不生成甲烷。培养48h内，马的粪便、兔盲肠内容物、奶牛和湖羊瘤胃内容物富集的产乙酸菌分别可以利用4.75、5.17、5.53和5.23moles的氢气生成1 mole的乙酸，马粪便内富集的产乙酸菌氢利用效率显著高于其他样品(P＜0.05)。同为反刍动物的奶牛和湖羊，瘤胃内容物中富集的产乙酸菌在48h的培养过程中，氢气消耗量无显著差异，但是乙酸生成的量湖羊显著高于奶牛(P＜0.05);同为单胃草食动物的马和兔子，富集的产乙酸菌在48 h的培养过程中，氢气消耗量无显著差异，但是乙酸生成的量马显著高于兔子(P＜0.05)。所有样品的产乙酸菌富集培养物均可生成丁酸，并且马粪便样品显著高于其他样品(P＜0.05)。
　　4.单独或联合添加外源产乙酸菌TWA4和酵母培养物对瘤胃发酵和产乙酸菌群落的影响:试验采用2×2双因素试验设计，产乙酸菌TWA4的添加量为0和2×107cells/ml，酿酒酵母发酵物XP的添加量为0和2g/L。研究发现，单独添加XP以及TWA4和XP联合添加可增加挥发性脂肪酸产量(P＜0.05)，TWA4和XP联合添加显著增加了甲烷生成量(P＜0.05)。基于对产乙酸菌功能基因FTHFS的定量，发现单独添加TWA4、XP以及两者联合添加均增加了产乙酸菌的数量，且其增长幅度高于产甲烷菌。各处理组的产乙酸菌均以Lachnospiraceae为主，但与已培养的微生物相似性较低。与Acetitomaculumruminis具有低相似性（相似度86％）的一类未知的产乙酸菌在各处理中均占优势，但XP的添加增加了与Eubacterium limosum具有低相似性（相似度70％）的未知产乙酸菌的数量。与XP不同，TWA4及其与XP的联合添加使与A.ruminis具有低相似性的一类未知的产乙酸菌的数量增加，与E.limosum具有低相似性的未知产乙酸菌的数量降低。因此，外源添加产乙酸菌和（或）酵母可能通过调控瘤胃产乙酸菌群落组成对瘤胃发酵和甲烷生成产生影响。
　　5.产甲烷菌抑制剂-氯仿对瘤胃发酵、甲烷生成和微生物群落的影响:饲喂精粗比为40∶60的混合日粮和仅饲喂粗饲料两种饲养模式下，选取体重相似的八头健康肉牛（每种饲喂方式各四头）进行为期78天的动物试验。根据氯仿添加量分为4个处理:基础饲粮（精粗比为40∶60的混合日粮或干草）加环糊精为对照组;在对照组基础上添加1.0g/100kg LW（Live weight）的环糊精氯仿为低剂量组;在对照组基础上添加1.6g/100kg LW的环糊精氯仿为中剂量组;在对照组基础上添加2.0 g/100 kg LW的环糊精氯仿（粗饲料饲养模式）或添加2.6g/100kg LW的环糊精氯仿（精粗比为40∶60的混合日粮饲养模式）为高剂量组。研究发现，氯仿的添加均对肉牛的采食量无显著性影响。仅饲喂粗饲料时，氯仿的添加会使动物采食3h后瘤胃液氨态氮浓度显著升高(P＜0.05)，高剂量的添加会使挥发性脂肪酸产量显著下降;而饲喂混合日粮时，三种剂量氯仿的添加未对瘤胃液氨态氮浓度和挥发性脂肪酸浓度造成显著性影响。两种饲喂模式下，中、高剂量氯仿的添加均使动物的甲烷排放量显著降低(P＜0.01)，氢气的排放量显著增多(P＜0.05)，并且采食前后瘤胃液的乙酸浓度显著降低(P＜0.01)，丙酸浓度显著升高(P＜0.05)，乙丙比显著下降(P＜0.01)。饲喂混合日粮时，低、中剂量氯仿的添加均使产琥珀酸丝状杆菌和原虫的数量显著增加(P＜0.05)，高剂量氯仿使Methanobrevibacter ruminantium和功能基因mcrA的基因拷贝数显著降低(P＜0.05)，但是Rumen cluster C的数量显著升高(P＜0.05);仅饲喂粗饲料时，中、高剂量氯仿的添加显著增加了白色瘤胃球菌的数量(P＜0.05)，对其他菌群的数量无显著性影响。两种饲喂模式下，三种剂量氯仿的添加均使瘤胃微生物菌群的组成发生了改变，并且显著地改变了瘤胃内某些与纤维分解和甲烷生成有关的菌属的丰富度(P＜0.05)，与丙酸和丁酸生成相关的菌属Succiniclasticum和Butyrivibrio的丰富度也发生了显著性改变(P＜0.05)，与非甲烷生成的氢代谢通路密切相关的菌属如Desulfovibrio的丰富度也发生了显著性变化(P＜0.05)。氯仿对瘤胃微生物菌群的影响具有一定的持续性，停止使用15天后，瘤胃微生物菌群组成与添加氯仿前明显不同，并且Ruminococcus、Methanobrevibacter等菌属的丰度度也发生了显著性变化(P＜0.05)。
　　6.抑制瘤胃甲烷生成的基础上外源添加产乙酸菌TWA4和间苯三酚对瘤胃发酵和甲烷生成的影响:选取八头体重相似的健康肉牛进行为期79天的动物试验，试验分两阶段进行。第一阶段根据是否添加间苯三酚分为两个处理:基础日粮（精粗比为40∶60的混合日粮）加1.6g/100kg LW的环糊精氯仿为对照组;对照组基础上添加75g/100kg LW的间苯三酚为处理组。第二阶段根据是否添加产乙酸菌TWA4分为两个处理:基础日粮（精粗比为40∶60的混合日粮）加1.6g/100kg LW的环糊精氯仿，并添加700ml/d未接种TWA4的培养基为对照组;基础日粮（精粗比为40∶60的混合日粮）加1.6g/100kg LW的环糊精氯仿，并添加700ml/d的TWA4培养液为处理组。研究发现，与仅添加产甲烷菌抑制剂-氯仿的对照组相比，乙酸生成诱导剂间苯三酚的添加虽然没有进一步对甲烷生成造成显著性影响，但是肉牛的氢气排放量显著降低(P＜0.05)，并且肉牛采食3h后瘤胃液挥发性脂肪酸中乙酸含量显著升高(P＜0.05)，说明间苯三酚可以使甲烷生成过程受到抑制后多余的氢向乙酸合成方向进行。基于对产乙酸菌功能基因FTHFS的定量，发现间苯三酚的添加并没有对瘤胃液中产乙酸菌的数量产生显著性影响。与仅添加产甲烷菌抑制剂-氯仿的对照组相比，产乙酸菌TWA4的添加并没有进一步对肉牛的甲烷和氢气排放量产生显著性影响，瘤胃液氨态氮、挥发性脂肪酸以及乙酸浓度也未发生显著性变化，基于对产乙酸菌功能基因FTHFS的定量，发现TWA4的添加并没有对瘤胃液中产乙酸菌的数量产生显著性影响。
　　综上所述，草食动物消化道内有大量且丰富的产乙酸菌存在，并且由于宿主种类、消化道部位和宿主发育阶段的不同呈现出不同的群落组成特征。草食动物消化道内的产乙酸菌富集培养物可以将合成气（H2和CO2）转化为乙酸、丙酸、丁酸等能量物质，并且不同种类草食动物消化道内产乙酸菌的氢利用能力存在差异性。通过外源添加产乙酸菌来实现瘤胃甲烷减排效果不理想，配合使用酵母培培养物可以增加瘤胃内某些产乙酸菌的丰富度从而影响瘤胃发酵，在瘤胃产甲烷菌活动受到抑制时，间苯三酚可以促进瘤胃内乙酸生成途径的发生。

目录

声明

图表一览表

缩略词

摘要

第一章 文献综述

第一节 产乙酸菌的定义和菌群结构

1 产乙酸菌的定义

2 产乙酸菌的菌群结构

第二节 产乙酸菌的能量储存机制和代谢特点

1 产乙酸菌的能量转化途径多样

2 产乙酸菌的代谢底物多样

3 产乙酸菌的终端电子受体多样

第三节 产乙酸菌的生物学意义和应用前景

1 产乙酸菌的生物学意义

2 生产化学物质和生物燃料

3 调控反刍动物瘤胃发酵

第四节 影响草食动物消化道内优势氢利用菌种类的因素

1 草食动物消化道内优势氢利用菌的分布特征

2 影响草食动物消化道内优势氢利用菌分布的因素

第五节 产乙酸菌的研究手段

1 产乙酸菌的富集培养

2 分子生物学手段在产乙酸菌研究中的应用

第六节 本研究的目的、意义和内容

1 本研究的目的和意义

2 研究内容

第二章 产乙酸菌在草食动物胃肠道内的群落组成特征

第一节 宿主和消化道部位对产乙酸菌群落组成的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 发育阶段对草食动物消化道内产乙酸菌群落组成的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 草食动物消化道产乙酸菌富集培养物氢利用能力的研究

第一节 草食动物消化道内产乙酸菌数量的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 草食动物消化道产乙酸菌富集培养物的氢代谢特征

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章 产乙酸菌调控瘤胃甲烷生成的应用价值研究

第一节 联合添加外源产乙酸菌TWA4和酵母培养物对反刍动物瘤胃发酵和产乙酸菌群落的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二节 抑制产甲烷菌的基础上外源添加TWA4和间苯三酚对瘤胃发酵、甲烷生成和瘤胃产乙酸菌数量的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第五章 总结、创新点和后续研究展望

1 总结

2 创新点

3 后续研究展望

附录

参考文献

致谢

作者简介