两个拟南芥WRKY基因及本氏烟乙醇酸氧化酶基因家族的抗病调控功能分析

摘要

活性氧是植物抗病性的重要调控因子。目前已知的植物与病原物互作中产生活性氧的重要途径有两条，一是由NADPH氧化酶(Rboh基因编码其亚基)催化产生超氧阴离子;另一条是由乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，GOX)在光呼吸途径中催化产生H2O2。最近有研究发现，WRKY可能参与调控ETI(Effector-triggeredimmunity)和PTI(PAMP-triggered immunity)抗性和活性氧积累。许多WRKY转录因子在植物抗病调控中发挥重要作用，但不同WRKY转录因子针对不同病原物的抗性有显著区别。目前，拟南芥WRKY6在抗病性中的作用尚不明确，WRKY8在抗病中的研究也较少。这两个WRKY对活性氧的调控作用还不明确。此外，GOX对不同病原物的调控作用区别明显。本论文研究分析了两个拟南芥WRKY基因AtWRKY6和AtWRKY8以及本氏烟GOX基因家族对菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum，Ss）和稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）抗性和活性氧积累的调控作用及机制。获得的主要结果如下:
　　(1)明确了AtWRKY6和AtWRKY8基因的抗病调控功能。利用敲除突变体和过表达转基因植株的抗病分析结果表明，AtWRKY6和AtWRKY8基因在拟南芥对Ss的寄主抗性中均起正调控作用，但在对Xoo的非寄主抗性中却起不同调控作用，AtWRKY6起正调控作用，而AtWRKY8基因却起负调控作用。
　　(2)阐明了AtWRKY6和AtWRKY8基因的抗病调控机理。敲除突变体和过表达转基因植株的DAB染色结果表明，AtWRKY8正调控、而AtWRKY6基因负调控Xoo诱发的活性氧积累。qRT-PCR基因表达检测结果表明，AtWRKY6和AtWRKY8基因在非接种时和接种Xoo后早期(6 hpi)通过调节RbohD、RbohF、GOX1和HAOX1基因表达调控Xoo诱发的活性氧积累。此外，利用敲除突变体和过表达转基因植株的活性氧定量检测分析结果显示，AtWRKY6正调控细菌PAMP(fig22)激发的活性氧积累、却负调控真菌PAMP(chitin)诱导的H2O2积累和拟南芥DAMP(AtPep1)诱发的活性氧积累;而AtWRKY8则负调控所有上述PAMP和DAMP激发的活性氧积累。说明AtWRKY6和AtWRKY8基因参与调控PTI和DTI抗性。苯胺蓝染色分析发现，AtWRKY6正调控、而AtWRKY8则负调控Ss侵染诱发的胼胝质沉淀。过表达35S∶ WRKY6-9植株与wrky6突变体植株接种和不接种Ss的差异转录组分析结果显示，WRKY6通过调控包括SARD1、EDS1、EDS5、NIMIN-1、NIMIN-2、NPR2-5等在内的SA转运和信号传导通路在基础抗性中起重要作用，而面对Ss的侵染，WRKY6通过下调一组抗性负调控因子，包括MLO、EDR2、BON3、BAP和NUDT7，诱导对Ss的抗性，同时通过活化Rapid alkalinization factor(RALF)和GLP抵抗Ss产生大量草酸引起的强酸性，并通过负调控FLS2的降解因子PUB12/24、chitin触发PTI的关键因子LYM2、CERK1、BAK1和BIK1，以及PEP1-3及其受体PEPR2，分别正调控fig22激发的PTI、负调控chitin诱发的PTI以及AtPep1诱发的DTI。
　　(3)利用生物信息学方法在基因组水平鉴定了本氏烟GOX基因家族，并利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技术分析明确了其中Nb HA OX8、NbGOX1和NbGOX4对Ss和Xoo抗性的调控作用。获得了16条本氏烟GOX基因序列。序列分析结果显示，它们均包含一个alpha_hydroxyacid_oxid_FMN结构域，与NCBI-CDD中的结构域相比，该结构域中第二个催化残基之后含有一个大小为43～53个氨基酸的插入序列(NbHAOX3和NbHAOX6除外)。VIGS基因功能分析结果表明，NbGOX1和NbHAOX8基因负调控对Xoo的非寄主抗性，不显著影响对Ss的抗性，而NbGOX4基因则正调控对Xoo的非寄主抗性以及对Ss的寄主抗性。
　　(4)初步明确了本氏烟GOX基因的抗病调控机理。DAB染色结果显示，NbHAOX8和NbGOX1 VIGS植株中Xoo诱导的活性氧积累高于eGFP植株，而NbGOX4 VIGS植株中活性氧积累量却少于eGFP。表明NbGOX1和NbHAOX8基因负调控，而NbGOX4则正调控Xoo诱导的活性氧积累。定量检测结果显示，这三个基因均负调控细菌PAMP(flag22)诱导的活性氧积累。这三个基因不显著改变RbohD和RbohF基因的表达，说明它们对活性氧的调控与RbohD和RbohF基因的调控作用相互独立。此外，NbGOX4的沉默显著提高了其它两个基因的表达，表明NbGOX4可能通过调节NbHAOX8和NbGOX1发挥其调控功能。此外，NbGOX1可能通过SA途径、NbGOX4可能通过JA和WRKY45和WRKY62介导的途径调控植物抗病性;而NbHAOX8则可能通过其它未知途径调控植物抗病性。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述与研究背景

1 引言

1．1 非寄主抗性

1．2 活性氯与植物抗病性

1．3 AtWRKY8和AtWRKY6基因的研究进展

1．4 植物乙醇酸氯化酶基因家族的研究进展

1．5 本论文的研究目的和研究内容

第二章 拟南芥WRKY6和WRKY8基因的抗病调控功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 AtWRKY6和AtWRKY8基因对Ss的抗性调控功能及机制

3．2 AtWRKY6和AtWRKY8基因对Xoo的非寄主抗性调控功能及机制

3．3 AtWRKY6和AtWRKY8基因对PTI和DTI抗性的调控作用

3．4 AtWRKY6和AtWRKy8基因对病原菌接种诱导的胼胝质积累的调控作用

3．5 Ss接种处理前后wrky6突变体和过表达植株的转录组RNA Sequencing分析

4 讨论

4．1 AtWRKY6和AtWRKY8基因对植物抗病性的调控作用

4．2 AtWRKY6和AtWRKY8基因对植物抗病性的调控机制

第三章 本氏烟乙醇酸氧化酶基因家族鉴定及抗病功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 本氏烟GOX基因家族的鉴定及分析

3．2 本氏烟GOX和HAOX抗病调控功能的VIGS分析

4．讨论

4．1 本氏烟GOX基因家族的鉴定及序列特点

4．2 本氏烟GOX和HAOX基因的抗病调控功能及抗病机制

第四章 全文小结与研究展望

参考文献

附录