本氏烟抗疫病转录因子的筛选及两个WRKY类转录因子的抗病功能研究

摘要

转录因子(Transcription Factor)一般与启动子区域内的顺式作用元件特异性结合，调控目的基因在特定时空的表达。根据其DNA结合域(DNA-binding domain，DBD)可划分为不同的家族，包括AP2/ERF家族、WRKY家族、MYB家族、NAC家族等。植物中的转录因子在调控其生长发育、应答病原菌侵染等多种生物过程中起重要作用。研究植物中抗病相关转录因子，对获得新的抗病基因和了解植物抗病发生过程均有重要意义。本研究通过分析本氏烟与寄生疫霉互作转录组数据，并利用实时荧光定量PCR技术筛选到18个参与本氏烟的抗疫霉过程的转录因子;进一步通过基因同源比对的方法获得了两个抗病相关的转录因子，并初步研究了其参与本氏烟抗病的机制。
　　本氏烟中抗疫霉转录因子的筛选:为了寻找在本氏烟抗疫霉菌过程中发挥作用的转录因子，选择经过寄生疫霉(Phytophthora parasitica)侵染6h的本氏烟叶片，以未经处理的叶片为对照，建立本氏烟与寄生疫霉互作的转录组数据表达谱，利用生物信息学分析本氏烟在疫霉诱导下转录因子的差异表达情况。结果表明，有235个转录因子基因受疫霉诱导上调表达，参照已报道的拟南芥或普通烟中受病原菌诱导的转录因子，从中挑选了71个同源的上调表达4倍以上的基因，通过qRT-PCR的方法验证挑选基因的表达模式，最终获得18个表达4倍以上的基因，推测这18个基因可能直接参与本氏烟的抗疫霉过程。
　　本氏烟NbWRKY40转录因子的抗病功能研究:根据文献报道中拟南芥(Arabidopsis thaliana)和普通烟(Nicotiana tabacum)中具有抗病及抗胁迫功能的Ⅱa亚类WRKY40转录因子的序列，通过本氏烟转录组数据分析及基因同源克隆法，获取本氏烟中的NbWRKY40基因。通过实时荧光定量PCR检测该基因受疫霉诱导表达的情况，结果显示该基因受疫霉诱导上调表达。为了探究该基因在本氏烟中的抗病相关功能，利用病毒介导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing，VIGS)，分别用半活体营养型寄生疫霉和死体营养型灰霉菌作为测试菌株，检测基因沉默对本氏烟抗性指标的影响。结果表明，沉默Nb WRKY40基因降低了本氏烟对疫霉菌的抗性，同时细胞学观察表明，在接种点附近菌丝积累量增加、细胞坏死程度增强，过氧化氢积累和胼胝质沉积都明显减少。而该转录因子沉默也降低了本氏烟对灰霉菌的抗性。进一步检测NbWRKY40基因沉默对抗病信号通路相关基因PR1b、PR2b，LOX, ERF1的表达量的影响，结果表明，NbWRKY40基因沉默导致参与抗病和SA途径的PR1b、PR2b基因的疫霉诱导表达能力明显下降。推测Nb WRKY40基因可能依靠SA介导的信号通路参与调控本氏烟抗病性。
　　本氏烟NbWRKY1转录因子抗病相关功能研究:参考文献报道以及本氏烟转录组数据，在本氏烟中获得一个Ⅰ亚类的NbWRKY1基因，采用VIGS的方法来研究其在本氏烟中的抗病功能。结果显示，沉默NbWRKY1基因会降低本氏烟对于寄生疫霉和灰霉菌的抗性，对寄生疫霉菌的侵染情况进行染色观察，发现在侵染点附近的细胞死亡程度增强、过氧化氢的积累变少，但是胼胝质的沉积变化不明显。进一步检测了抗病通路下游的四个关键基因PR1b，PR2b，LOX， ERF1的表达量变化情况，结果显示，参与抗病和SA途径的PR1b，PR2b基因以及参与ETH途径的ERF1基因的表达能力均下降较为明显，据此推测NbWRKY1基因可能依靠SA及ETH介导的信号通路通参与调控本氏烟对寄生疫霉和灰霉的抗病防卫反应。

目录

声明

摘要

引言

上篇 文献综述

第一章 植物抗病反应及病毒介导的基因沉默

1 植物抗病反应

2 病毒介导的基因沉默

第二章 植物转录因子的研究进展

1 植物转录因子的功能结构域

2 植物转录因子的分类

3 植物转录因子的功能概述

4 总结与展望

下篇 研究内容

第一章 本氏烟中抗疫霉转录因子的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第二章 本氏烟NbWRKY40转录因子抗病相关功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第三章 本氏烟NbWRKY1转录因子抗病相关功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

参考文献

附录

全文总结与创新点

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢