生物转化-化学催化级联制备l-（+）-酒石酸

摘要

L-(+)-酒石酸是一种重要的羟基羧酸类螯合剂，在制药、食品、染料等工业中有着广泛的应用。目前，L-(+)-酒石酸主要来源是酿酒行业中“酒石”的提取，或者利用顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase，ESH)进行酶法生产制备。前者受到原料的限制，而后者主要依赖于底物马来酸酐，是一种以石化产品为原料的生产方式。进入21世纪以来，世界范围内石油资源的日益枯竭，以及国际原油价格的不稳定，这对以石油为原料的化学品制造业造成了巨大的压力，也使以生物质可再生资源为原料的可持续生产加工方式在全球范围内引起了广泛的关注。本论文在综述L-(+)-酒石酸的性质、用途、市场需求、生产方法及生物制造研究进展等内容的基础上，针对以糖类为原料的生物转化-化学催化级联制备L-(+)-酒石酸过程中反应选择性不高、产物综合得率低等问题，系统性地研究了5-酮-D-葡萄糖酸(5-KGA)高效合成Gluconobacter oxydans细胞工厂的构建、发酵过程优化与控制，以及5-KGA化学催化氧化制备L-(+)-酒石酸的工艺，提高了工艺的总体效率，为利用可再生资源生物制备L-(+)-酒石酸打下基础。
　　本文首先在分析氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans DSM2343生物合成5-KGA代谢途径的基础上，利用自杀质粒pJKM，通过同源重组方式，先后无痕敲除葡萄糖酸-2-脱氢酶基因和丙酮酸脱羧酶基因，切断2-KGA和副产物乙酸的代谢途径，构建工程菌G.oxydans ZJU2。通过摇瓶实验，该菌5-KGA的产量为20.89 g/L，是出发菌株的2.65倍。通过分析工程菌G.oxydans ZJU2分批发酵过程动力学参数μ、qs、 qp变化特性，设计一种简单、易操作的分阶段溶氧控制策略，以获得较高比生长速率，实现5-KGA高产量、高产率的相对统一。在15-L发酵罐上，起始葡萄糖浓度为100 g/L，最终细胞干重为3.8 g/L，5-KGA的产量约为75.66 g/L，产率为1.72 g/L·h，摩尔转化率为70.21％，然而发酵体系中仍有23.19g/L的葡萄糖酸残余，占初始葡萄糖的摩尔比为21.29％。
　　较高的中间产物葡萄糖酸积累量表明，葡萄糖酸向5-KGA转化的反应成了代谢途径的限速步骤，过表达催化该反应的酶可能有利于提高5-KGA的发酵水平。在优化表达系统启动子元件的基础上，分别克隆表达Gluconobacter的山梨醇脱氢酶基因及Xanthomonas campestris DSM3586的次级醇脱氢酶基因，对比分析工程菌G.oxydans ZJU2/pBB5-P0169-gcd和G.oxydans ZJU2/pBB5-P0169-sldAB合成5-KGA的能力。发酵64 h后，5-KGA的产量分别为119.14g/L和123.78g/L，产率分别为1.86g/L·h和1.93g/L·h，摩尔转化率分别为73.71％和76.58％。结果表明工程菌G.oxydans ZJU2/pBBR5-P0169-sldAB(G.oxydans ZJU3)更适合于5-KGA的合成。
　　过表达依赖于辅酶PQQ的膜结合sldAB基因后，会造成宿主菌本身PQQ的水平和酶量之间的不平衡，从而限制sldAB基因表达的效果。利用穿梭质粒pUCpr，在G.oxydans ZJU3中进一步强化辅酶PQQ合成模块及呼吸链电子传递模块，最终工程菌G.oxydans ZJU7，其PQQ水平达757.83±2.43μg/L，H+/O为2.01±0.16，醌醇氧化酶活力为0.80±0.06μmol/min、mg protein，同时5-KGA的批次发酵最高产量为144.52g/L，摩尔转化率约为84.07％，产率为2.26g/L、h（以发酵64h计算）。进一步对工程菌发酵体系进行过程控制优化，如起始葡萄糖浓度、氮源、pH、溶氧DOT、 Ca2+等。在此基础上，考察工程菌G.oxydans ZJU7流加补料条件，建立葡萄糖Fed-batch发酵工艺，发酵64h后，5-KGA的产量达到162g/L，摩尔转化率为83.31％，产率为2.53g/L·h。
　　以5-KGA为研究对象，考察碱性缓冲体系下化学催化5-KGA制备L-(+)-酒石酸的工艺。通过筛选，确定CuSO4·5H2O为催化剂，并优化其用量、反应温度、反应时间等。在30℃，220rpm，CuSO4·5H2O用量为0.5 g/L的条件下，100g/L的5-KGA-K在碱性缓冲体系中连续反应72h，5-KGA的摩尔转化率可以达73％-75％，选择率约为76.18％，相对于传统的NH4VO3、贵金属Pd-C等催化剂，具有成本低、无毒害、高效率等特点。最后考察CuSO4·5H2O催化过程特征官能结构的变化、紫外吸收的变化、以及Cu2+与5-KGA的配位数等，结合抗坏血酸氧化过程，提出不同于NH4VO3催化氧化的假设性机理。
　　以可再生原料出发，生物发酵-化学催化级联反应制备L-(+)-酒石酸可摆脱对石化资源的依赖，实现工业原料的战略转移，对提升我国酒石酸产业及其国际竞争力具有重要战略意义。

目录

声明

致谢

摘要

主要缩略符号说明

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 L-(+)-酒石酸概述

1．2．1 L-(+)-酒石酸的理化性质

1．2．2 L-(+)-酒石酸的用途

1．3 L-(+)-酒石酸生产概况

1．4 生物合成5-KGA的研究概况

1．4．1 氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)

1．4．2 葡萄糖的代谢及其相关基因

1．4．3 吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine，PQQ)

1．4．4 呼吸链电子传递系统

1．4．5 代谢工程技术在5-KGA生物合成中的应用

1．4．6 过程控制技术在5-KGA生物合成中的应用

1．5 糖质发酵生物制备L-(+)-酒石酸途径及机理

1．6 L-(+)-酒石酸的催化转化

1．7 论文研究意义和立题思想

1．8 论文主要研究内容

第二章 实验材料与方法

2．1 菌株与质粒

2．2 仪器与试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 工具酶及主要试剂

2．3 培养基和培养条件

2．3．1 培养基组成

2．3．2 抗生素用量

2．4 分子生物学相关方法

2．4．1 基因组的提取

2．4．2 质粒的提取

2．4．3 PCR扩增目的基因

2．4．4 PCR产物回收及凝胶回收纯化DNA

2．4．5 目的基因的酶切及连接

2．4．6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2．4．7 氧化葡萄糖酸杆菌感受态细胞的制备及转化

2．4．8 细胞的保存

2．4．9 菌落PCR快速检测

2．5 生物化学检测方法

2．5．1 pH的测定

2．5．2 细胞密度的测定

2．5．3 蛋白浓度测定

2．5．4 SDS-PAGE凝胶电泳

2．5．5 氧化葡萄糖酸杆菌膜组分的制备

2．5．6 酶活测定

2．5．7 H+／O比及呼吸链末端醌醇氧化酶活力测定

2．5．8 PQQ浓度的测定

2．6 仪器分析方法

2．6．1 葡萄糖浓度的测定

2．6．2 代谢产物的高效液相检测

2．6．3 乙酸的气相色谱检测

第三章 产5-KGA工程菌的代谢途径优化

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 主要工具酶

3．2．3 质粒DNA的提取及转化

3．2．4 DNA片段的酶切与连接

3．2．5 DNA片段的合成与测定

3．2．6 菌落PCR验证

3．2．7 自杀质粒pJKM的构建

3．2．8 敲除质粒的构建

3．2．9 GOX1231和GOX081的无痕敲除

3．2．10 产5-KGA重组菌的培养条件

3．2．11 动力学参数分析

3．2．12 重组菌的扩大培养

3．2．13 分析检测方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同初始葡萄糖浓度对G．oxydans ZJU1的影响

3．3．2 摇瓶发酵

3．3．3 动力学参数分析

3．3．4 分阶段溶氧控制5-KGA生物合成

3．4 小结

第四章 5-KGA生物合成途径关键酶的挖掘

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 主要工具酶

4．2．3 质粒DNA的提取及转化

4．2．4 DNA片段的酶切与连接

4．2．5 DNA片段的合成与测定

4．2．6 启动子的筛选

4．2．7 重组sldAB和gcd基因表达质粒的构建

4．2．8 sldAB和gcd基固重组菌的获得

4．2．9 膜组分的制备及蛋白浓度的测定

4．2．10 工程菌酶活的计算

4．2．11 产5-KGA工程菌的培养条件

4．2．12 分析检测方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 启动子筛选

4．3．2 酶活的测定

4．3．3 工程菌的放大培养

4．3．4 外源补加辅酶PQQ

4．4 小结

第五章 辅酶PQQ合成途径及呼吸链的改造

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 菌株和质粒

5．2．2 主要工具酶

5．2．3 质粒DNA的提取及转化

5．2．4 DNA片段的酶切与连接

5．2．5 DNA片段的合成与测定

5．2．6 基因组模板的提取

5．2．7 PCR扩增

5．2．8 穿梭表达质粒pUCpr的构建

5．2．9 pqqABCDE基田簇表达质粒的构建及重组菌的获得

5．2．10 cyoBACD基因簇表达质粒的构建及重组菌的获得

5．2．11 PQQ浓度的测定

5．2．12 H+／O比及呼吸链末端醌醇氧化酶活力测定

5．2．13 工程菌扩大培养

5．2．14 OTR、CTR及RQ的测定

5．2．15 分析检测方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 PQQ合成基因的表达

5．3．2 呼吸链电子传递途径改造

5．3．3 工程菌呼吸熵RQ

5．3．4 工程菌H+／O比及醌醇氧化酶活力

5．4 小结

第六章 工程菌产5-KGA的过程控制和补料发酵

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 菌株

6．2．2 培养基及培养条件

6．2．3 培养基及培养条件优化

6．2．4 发酵工艺调控

6．2．5 分析检测方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 不同初糖浓度对5-KGA合成的影响

6．3．2 有机氮源对5-KGA合成的影响

6．3．3 pH对5-KGA合成的影响

6．3．4 溶氧DOT对5-KGA合成的影响

6．3．5 不同CaCO3浓度对5-KGA合成的影响

6．3．6 流加补料方式对5-KGA合成的影响

6．3．7 Fed-batch发酵工艺确立

6．4 小结

第七章 化学催化5-KGA转化为L-(+)-酒石酸

7．1 引言

7．2 材料与方法

7．2．1 材料设备

7．2．2 5-KGA-K氧化反应条件

7．2．3 反应物的测定分析

7．2．4 催化剂的选择

7．2．5 CuSO4·5H2O催化剂氧化条件分析

7．2．6 H2O2对CuSO4·5H2O催化氧化的影响

7．2．7 Pd-C催化氧化效果分析

7．2．8 CuSO4·5H2O催化特性分析

7．2．9 CuSO4·5H2O催化机理探讨

7．3 结果与讨论

7．3．1 反应产物测定

7．3．2 不同过渡金属对催化的影响

7．3．3 CuSO4·5H2O催化条件优化

7．3．4 H2O2对CuSO4·5H2O催化氧化的影响

7．3．5 Pd-C催化氧化

7．3．6 CuSO4·5H2O催化氧化过程解析

7．3．7 CuSO4·5H2O催化5-KGA反应机理

7．3．8 CuSO4·5H2O物料衡算

7．4 小结

第八章 可再生资源制备L-(+)-酒石酸的工业实用性

8．1 材料与方法

8．1．1 菌株

8．1．2 培养基及培养条件

8．1．3 5-KGA钙盐的化学催化

8．1．4 分析检测方法

8．2 结果与讨论

8．2．1 生料发酵条件考察

8．2．2 5-KGA钙盐回收

8．2．3 5-KGA钙盐的化学催化

8．2．4 L-(+)-酒石酸生产工艺流程

8．3 小结

第九章 结论与展望

9．1 结论

9．2 创新点

9．3 展望

参考文献

附录

作者简介

在学期间所取得的科研成果