生物膜-硅纳米孔阵列光学传感器及药物筛选系统的构建

摘要

生物膜系统具有阻挡外源伤害，维持生命活动稳定、有序进行的功能。生物膜系统作为生物体的外层结构，为生命活动的进行提供必要的能量、信息、物质的交换。生物膜系统的选择性通透能力为生物体提供交换途径的同时也起到保护作用。对于作用靶点在胞内的药物，其发挥作用的先决条件是要穿透细胞膜进入细胞内。然而生物膜的屏障作用阻止了许多药物的渗透，从而很大程度上限制了这类药物分子的生物利用率。因而，生物膜渗透能力成为药物筛选的重要研究内容。
　　近三十年间，生物膜系统的功能性与药物渗透性研究由复杂的体内实验逐渐发展到体外实验。体外模型涵盖了计算机模拟、分子水平、人工膜水平、细胞水平、组织水平实验等诸多方式。然而在渗透性检测方法上的突破十分有限，目前的研究报道大多基于荧光标记、电学信号检测等模式。然而部分荧光标记分子对细胞功能可能具有一定的影响，且荧光修饰改变了药物分子的原有结构，难以在接近真实环境中进行药物渗透能力的检测。电学信号检测的芯片结构和设备较为复杂，电极容易受到污染，方法重现性较差。为克服现有研究方法的缺点，本论文旨在建立一种非标记光学检测方法，用于生物膜功能和药物渗透性的研究。论文构建了基于硅纳米孔阵列的支撑人工生物膜系统，利用硅纳米孔阵列的微结构和反射干涉光学现象研究了人工生物膜系统对纳米孔的封闭效应。在所构建的光学传感平台上研究了离子通道蛋白对氢离子的选择性通透功能，同时研究了肽类物质的跨膜行为，以及药物分子跨越内皮细胞的能力。上述研究工作为非标记光学传感器应用于药物筛选奠定了基础。本论文的主要内容如下:
　　(1)构建了一种硅纳米孔阵列-水凝胶复合材料支撑型人工细胞膜系统，在H+敏感水凝胶的信号放大作用下，研究了复合材料在微环境下对H+的高灵敏传感能力，采用微流控技术成功构建了纳米孔阵列支撑的磷脂双分子层(Phospholipid bilayers，PLBs)，傅里叶变换反射干涉光谱（Fourier transferred-reflectometric interference spectrum，FT-RIS）结果表明PLBs能有效阻断溶液中的H+向纳米孔阵列的扩散。在PLBs中镶嵌离子通道蛋白（短杆菌肽A）后，该人工细胞膜恢复了部分离子通透功能。在此基础上研究了离子通道抑制剂的抑制作用，建立了离子通道靶向药物筛选的模型。
　　(2)构建了一种硅纳米孔阵列表面支撑型人工细胞膜系统，基于人工细胞膜对纳米孔阵列表面非跨膜生物分子的封闭作用，建立了多肽跨越细胞膜过程的实时光学检测方法，研究了TP2、Cecropin A、hIAPP、Dermaseptin等多种跨膜肽(Membrane-translocating peptides，MTPs)分子跨越细胞膜的动力学过程，建立了不同类型MTPs的区分模型，结果与真实微生物抗菌结果、真实细胞膜相互作用结果相吻合。最终建立了针对载体型MTPs和抗菌型MTPs的药物筛选模型。
　　(3)构建了一种硅纳米孔阵列支撑的体外血脑屏障（Blood-brain barrier, BBB）系统，基质胶Matrigel(@)共培养状态下成功实现了人脑微血管内皮细胞hBMECs的体外培养并形成了紧密连接结构。基于BBB对纳米孔阵列表面非渗透型分子的封闭作用，建立了体外BBB的非标记光学检测方法，研究了不同培养时间下体外BBB通透性的改变，用乙酰胆碱、荧光素钠等模型分子验证了所构建的体外模型。用该模型测试了氯霉素、环丙沙星、红霉素等多种抗生素对BBB的渗透能力，建立了脑外伤药物的体外筛选模型。
　　(4)构建了一种硅纳米孔阵列表面固定微生物层的系统，基于硅纳米孔阵列的封闭效应，建立了微生物的非标记分析方法。将特定抗体（E.Coli抗体）固定于纳米孔阵列表面并捕获E.Coli后，微生物层对纳米孔阵列的分子通透产生阻碍作用。以BSA作为探针分子，通过测量不同封闭状态下BSA对多孔层光学信号的变化，建立了用于微生物层密度定量分析的非标记光学方法，上述方法在抗菌药物筛选中具有潜在的应用价值。
　　(5)论文的最后一章介绍了作者在美国斯坦福大学医学院交流访问期间所做的研究工作，建立了一种用于疾病诊断的比色阵列传感器。该比色阵列对不同来源的尿液样本能产生特征光学响应，利用成像系统和信息学图像分析方法提取光学响应信号，并利用统计学算法筛选出阵列式传感的最优化组成。在最优化条件下实现了川崎病和普通发烧患者之间的区分，在训练组中灵敏度和特异性分别为0.94和0.91（其ROCAUC值达到0.981），测试组中则达到0.94和0.82（ROCAUC值为0.873）。利用统计学算法进行文献信息挖掘并探讨了该传感器的作用机理。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 人工细胞膜

1．1．1 细胞膜

1．1．2 人工细胞膜简介

1．1．3 人工细胞膜的分类

1．1．4 悬浮型人工细胞膜系统

1．2 固体支撑型人工细胞膜

1．2．1 固体支撑人工细胞膜的制备

1．2．2 高聚物支撑人工细胞膜

1．2．3 固体支撑膜的检测方法

1．2．4 微流控芯片中的人工膜

1．3 体外血脑屏障模型

1．3．1 血脑屏障简介

1．3．2 体外血脑屏障模型

1．3．3 体外血脑屏障模型的检测方法

1．4 多孔硅材料

1．4．1 多孔硅材料的简介

1．4．2 多孔硅光学传感器

1．4．3 多孔硅在支撑人工膜体系中的应用

1．5 本课题研究的主要内容

第二章 基于硅纳米孔阵列-水凝胶的支撑人工细胞膜系统研究离子通道蛋白的功能及其靶向抑制剂的药物筛选

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器和试剂

2．2．2 硅纳米孔阵列-壳聚糖复合传感芯片的制备

2．2．3 微流控芯片的制备

2．2．4 人工细胞膜的构建

2．2．5 荧光漂白后恢复实验

2．2．6 离子通道蛋白的镶嵌

2．2．7 实时反射干涉光谱的检测

2．2．8 离子通道蛋白靶向抑制剂的筛选

2．3 实验结果和讨论

2．3．1 光学检测原理

2．3．2 复合芯片对氢离子的响应

2．3．3 硅纳米线阵列-壳聚糖支撑人工细胞膜的构建

2．3．4 离子通道蛋白功能的研究

2．3．5 靶向抑制剂对离子通道蛋白的抑制作用

2．4 本章小结

第三章 基于硅纳米孔阵列的支撑人工细胞膜系统研究肽跨越细胞膜的动力学过程及跨膜肽的药物筛选

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器和试剂

3．2．2 微流控乡孔硅复合人工细胞膜芯片的制备

3．2．3 FRAP实验验证人工细胞膜的流动性

3．2．4 反射干涉光谱检测

3．2．5 微生物的培养与肽的相互作用实验

3．2．6 不同类型肽的跨膜动力学检测

3．3 实验结果和讨论

3．3．1 多孔硅材料表面支撑型人工细胞膜微流控芯片的表征

3．3．2 反射干涉光谱检测原理

3．3．3 多孔硅-人工细胞膜复合芯片对MTPs的筛选

3．3．4 多孔硅-人工细胞膜复合芯片研究肽与细胞膜相互作用的动态响应过程

3．3．5 肽与真实细胞膜的相互作用

3．4 本章小结

第四章 基于硅纳米孔阵列的体外血脑屏障模型的构建及其在药物筛选中的应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料和仪器

4．2．2 多孔硅材料的制备

4．2．3 多孔硅材料的表面生物相容性修饰

4．2．4 简易微流控细胞培养与液体流通装置的制备

4．2．5 基于多孔硅芯片的体外血脑屏障模型的构楚

4．2．6 紧密连接蛋白的免疫荧光染色

4．2．7 光学信号检测

4．2．8 血脑屏障通透性的测定

4．2．9 抗生素的筛选

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 多孔硅材料的生物相容性

4．3．2 芯片表面hBMECs细胞的培养

4．3．3 体外血脑屏障模型的紧密连接结构

4．3．4 多孔硅的光学信号

4．3．5 血脑屏障的通透性

4．3．6 光学检测法验证血脑屏障结构的完整性

4．3．7 抗生素的浓度相关性筛选

4．4 本章小结

第五章 基于硅纳米孔阵列的表面固定微生物层的构建及其在药物筛选中的应用

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 仪器和试剂

5．2．2 多孔硅的制备

5．2．3 徼流控芯片的制备

5．2．4 多孔硅芯片中E．coli抗体的修饰

5．2．5 微生物的培养与捕获

5．2．6 检测装王

5．2．7 荧光染色实验

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 基于FT-RIS的光学传感机理

5．3．2 光学探针和硅纳米孔尺寸的选择

5．3．3 基于间接FT-RIS法检测微生物层

5．3．4 选择性和特异性

5．4 本章小结

第六章 基于比色阵列的光学生物传感器的构建及其在医学诊断中的应用

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验材料和设备

6．2．2 伦理学认证

6．2．3 病人人口统计学资料与样本处理

6．2．4 比色传感阵列的制备

6．2．5 数码图像分析与标准化输出

6．2．6 诊断算法的选择与统计分析

6．2．7 传感化合物文献数据库挖掘

6．3 实验结果与讨论

6．3．1 人口统计学分析

6．3．2 比色传感阵列和特征化合物的选择

6．3．3 川崎病诊断用比色I捌的检验

6．4 本章小结

第七章 总结与展望

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

作者攻读博士学位期间主要科研成果