RNA互斥可变剪接相关的顺式元件及其二级结构的鉴定和进化保守性研究

摘要

可变剪接(Alternative splicing)能将一条Pre-mRNA剪接加工后产生不同的成熟mRNA，翻译产生不同的蛋白质，增加了蛋白质的多样性。互斥剪接是可变剪接的一种重要的方式，最典型的互斥可变剪接的例子是黑腹果蝇唐氏综合症细胞黏附因子（Dscam），果蝇的Dscam基因能够通过互斥剪接产生38，016种不同的异构体，但是由于该基因十分复杂，深入研究十分困难。目前对互斥剪接机制的研究尚不清楚。果蝇多效耐药性蛋白（multidrug-resistance protein，MRP）中也存在互斥剪接的现象，MRP基因能够通过互斥剪接产生16种不同的异构体，目前没有相关文献对MRP基因的互斥剪接机制的报道，因此对MRP基因及其它相关基因的剪接机制的研究有助于进一步对剪接机理的理解。
　　首先，通过生物信息学的分析果蝇MRP基因的外显子8簇中存在两种情况，一种为7个可变外显子的情况，另一种为8个可变外显子的情况。在7个可变外显子的外显子8簇中发现一对RNA二级结构，在8个可变外显子的外显子8簇中发现两对RNA二级结构，实验验证结果表明:MRP基因7个可变外显子的外显子8簇中预测的RNA二级结构在互斥剪接中起调控作用，进一步实验还表明在8个可变外显子的外显子8簇中双向RNA二级结构能够调控互斥剪接。其次，本研究利用生物信息学手段比对分析了其它基因RNA二级结构调控互斥剪接现象。分析结果显示了3个基因存在RNA二级结构，这3个基因分别是Nc73EF基因、Srp基因和Eb1基因。其中Srp基因中发现了双向RNA二级结构，为进一步揭示互斥剪接机制提供了基础。
　　对一部分节肢动物的代表性物种Dscam基因的外显子4簇、外显子6簇、外显子9簇进行了系统进化分析。分析结果显示:鳞翅目、膜翅目、鞘翅目Dscam基因及甲壳纲的外显子4簇、外显子6簇、外显子9簇均存在RNA二级结构，其中外显子6簇保守性最好，锚定序列在所有分析物种是高度保守，外显子4簇和外显子6簇具有物种序列特异性，但RNA二级结构均具有进化保守性，这些分析结果表明RNA二级结构介导互斥剪接的保守性。
　　最后，为了进一步开展对RNA可变剪接在蛋白质水平上的研究，对模式生物果蝇的RNA剪接相关蛋白互作用网络进行了进化分析，并且对隆头蛛（Stegodyphus mimosarum）剪接相关蛋白互作网络进行了系统的预测，分析结果显示:果蝇与人类和拟南芥的部分剪接相关蛋白互作网络存在进化保守性，并且在S.mimosarum中预测了19个剪接相关蛋白，构建了剪接相关蛋白互作网络。这些信息为进一步研究可变剪接相关蛋白提供了线索。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1 可交剪接的研究背景及进展

1．1 可变剪接的分析技术获常见模式

1．2 可交剪接的起源和进化

1．3 可变剪接的调控机制

1．4 可变剪接与疾病

1．5 可变剪接的生物学意义

2 互斥剪接的研究进展

3 黑腹果蝇MRP互斥剪接研究背景及进展

4 果蝇Dscam基因互斥剪接的研究背景及进展

5 蛋白相互作用研究背景及进展

6 本项目研究内容和意义

7 本项目研究技术路线

7．1 实验方案

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．2 主要实验仪器和试剂

2．2．1 主要实验仪器

2．2．2 主要试剂和耗材

2．3 实验室常用试剂配制

2．4 MRP基因

2．4．1 果蝇相关物种MRP基因序列信患的收集和生物信患学分析

2．4．2 果蝇MRP引物设计

2．4．3 RCR产物连接

2．4．4 转化

2．4．5 DNA和RCR产物的回收

2．4．6 质粒DNA提取

2．4．7 T载体或PMT/V5载体杓建的载体的酶切鉴定

2．4．8 果蝇S2细胞的培养

2．4．9 果蝇S2细胞转染

2．4．10 果蝇材料及果蝇S2细胞的RNA抽提

2．4．11 RNA反转录

2．4．12 目的片段的霹切鉴定

2．4．13 果蝇物种DNA模板的制备

2．5 Dscam基因

2．5．1 Dscam基因的引物设计

2．5．2 Dscam基因相关目的片段的克隆实验方法同2．4

2．5．3 DNA的抽提

2．5．4 RNA的抽提

第三章 果蝇脚互斥可变剪接相关的顺式元件及其二级结构的进化保守性分析

3．1 研究背景和立项依据

3．2 实验结果与分析

3．2．1 实验室两套果蝇MRP互斥剪接mini基因表达系统

3．2．2 果蝇御基因外显子8簇剪接强度分析

3．2．3 果蝇御基因外显子8簇内含子上的保守性分析

3．2．4 果蝇脚垆基因调控元件的研究

3．2．4 果蝇脚基因中I姒二叛结构介导的互斥可交剪接

3．3 总结与讨论

第四章 Dscam互斥可变剪接相关的顺式元件及其RNA二级结构的进化保守性分析

4．1 Dscam基因外显子4簇互斥可变剪接顺式元件及RNA二级结构的分析

4．2 Dscam基因外显子6簇互斥可变剪接顺式元件及RNA二级结构的分析

4．3 Dscam基因外显子9簇互斥可交剪接顺式元件及RNA二级结构的分析

4．3．1 Dscam基因外显子9簇进化保守性分析

4．3．2 Dscam基因外显子9簇颅式元件及RNA二级结构的分析

4．4 总结与讨论

第五章 果蝇Nc73EF、Srp和Eb1等基因互斥可变剪接相关的顺式元件及其二级结构的进化保守性分析

5．1 研究背景和立项依据

5．2 结果与分析

5．2．1 果蝇Nc73EF基因互斥可变剪接相关颅式作用元件和RNA二级结构分析

5．2．2 果蝇Eb1基因互斥可变剪接相关版武作用元件和RNA二级结构分析

5．2．3 果蝇Srp基因互斥可交剪接相关顺武作用元件和RNA二级结构分析

5．3 结论和总结

第六章 RNA互斥可交剪接相关的蛋白的基因进化保守性初步分析

6．1 研究背景与立项依据

6．2 果蝇等模式生物剪接因子蛋白互作网络进化分析

6．3 S．mimosarum在模式生物中的直系同源基因的预测

6．3 S．mimodsarum直系同源基因不同物种中保守基因

6．4 S．mimosarum蛋白相互作用预测

6．5 商节点数分析

6．6 GO分类的分析

6．7 S．mimosarum参与剪接的蛋白相互作用预测

6．8 结论和总结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 未来的工作展望

参考文献