抗真菌化合物bacilysin的制备、抑菌机制研究及结构改造的探索

摘要

作者筛选得到一株能显著抑制白色假丝酵母(Candida albicans)生长的菌株，通过测序确定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ZJU-2011)。论文首先在5L罐中进行发酵工艺优化，确定发酵条件为:通气量500 L/h，搅拌转速500 r/min，接种量10％(v/v)，装液量为60％(v/v)。抗真菌效价在30h时达到了6.9×103 U/mL。进一步对工艺进行3T罐放大，效价达到了8.5×103 U/mL。在此基础上采用色谱技术对抗真菌化合物进行分离纯化，首先利用乙醇沉淀和大孔树脂吸附去除了可溶物中约84.6％的杂质。再通过反相层析获得抗真菌有效部位，迸一步通过凝胶过滤层析，得到两个高纯度的组分。最后利用MS和NMR确定这两个抗真菌化合物为bacilysin和chlorotetaine。随后开发了一条适合于规模化提取bacilysin的低压色谱工艺，产品回收率达到76％以上，纯度达到95％。
　　体外抑菌试验测定了bacilysin对6株常见病原真菌的最低抑菌浓度(MICs)，结果表明他们对试验菌株具有明显的抑制效果(MICs在0.9-7.8μg/mL之间)，其中对克鲁氏假丝酵母抑制效果最佳。急性毒性实验显示bacilysin对昆明种小鼠的半致死量(LD50)达到135.3 g(bacilysin)/kg。体外肝微粒代谢实验拟合了bacilysin的代谢模型。
　　为了明确bacilysin的抑菌机理，对来源于Candida albicans的靶酶-葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(Gfa)实现了高效异源表达。通过比较发现N末端的标签会严重影响其转氨酶的活性，并且bacilysin对C-His Gfa的转氨酶活性抑制效果更强，而对N-His Gfa的抑制作用则显著变弱。反应动力学的研究发现:bacilysin与靶酶之间的相互作用是一个线性混合型抑制反应。bacilysin能够直接与靶酶发生作用，抑制其转氨酶活性。
　　进一步，通过分子模拟对bacilysin抑菌机理进行了模拟。首先，对构成bacilysin的非蛋白质氨基酸-anticapsin和bacilysin的跨膜转运过程进行了模拟。通过对接发现bacilysin能够以合理的构型稳定地存在于转运蛋白的内部，而anticapsin不能与转运蛋白发生有效的作用。动力学模拟显示，当体系达到平衡状态时，bacilysin能与转运蛋白形成稳定的复合物。特别的是，仅在bacilysin与转运蛋白的复合物结构中，发现了影响转运的盐桥(Glu403与配体的N末端氨基之间)。其次，对anticapsin和bacilysin与Gfa之间的相互作用进行了模拟。通过对接发现bacilysin和anticapsin都能在Gfa转氨酶的活性中心以一种相对合理的构型存在。该过程的动力学模拟显示整个的过程中bacilysin与Gfa的相互作用更强。当体系达到平衡时:Gfa的催化残基Cys会朝向bacilysin发生一定角度的偏转，然后Cys上的-SH会对bacilysin中羰基C进行亲核攻击，形成C-S共价键。由此可以认为bacilysin由于更加高效的跨膜转运效率导致了其比anticapsin更高的抗真菌活性。
　　最后，论文构建了一个能特异性无痕敲除ZJU-2011中bacD基因的复制型质粒-pBAC-CE以高效生产anticapsin。通过对ZJU-2011的感受态制备以及其电转条件进行优化，确定最佳电转条件:菌体OD6000.8-0.9，电场强度2.5 kV，电阻200 Q，复壮时间4h。在此条件下，将经过SacI线性化的pBAC-CE质粒导入到ZJU-2011感受态细胞中。通过二次同源重组得到了敲除bacD基因的工程菌，通过产物分离及HPLC-MS认为其分子结构应为anticapsin。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 真菌感染与抗菌化合物的研究

1．1．1 真菌感染

1．1．2 典型的真菌致病菌

1．1．3 新型抗真菌药物的迫切需要

1．1．4 新型抗真菌抗生素的来源

1．1．5 芽孢杆菌抗菌代谢产物的研究进展

1．2 Bacilysin的研究进展

1．2．1 Bacilysin的发现

1．2．2 Bacilysin的生物合成

1．2．3 Bacilysin生物合成途径的调控方式

1．2．4 Bacilysin类化合物的作用机理

1．2．6 Bacilysin主要的发展限制因素

1．3 新型小分子肽类化合物的研发

1．3．1 小分子肽类化合物的优势与不足

1．3．2 小分子肽类化合物的研发方向

1．4 计算机辅助药物设计在新药创制中的应用

1．4．1 虚拟筛选在筛选先导化合物中的应用

1．4．2 基于结构的药物设计

1．5 本课题的研究思路与主要内容

1．5．1 研究思路

1．5．2 研究内容

第二章 抗生素生产菌株的筛选及罐上发酵优化

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 菌种

2．2．2 实验仪器

2．2．3 主要试剂

2．2．4 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 发酵过程中糖、菌体量以及抗真菌药物效价的测定方法

2．3．2 抗生素标准曲线的绘制

2．3．3 抗生素生产菌株的鉴定

2．3．4 5L发酵罐发酵生产抗生素的单因素优化

2．3．5 5L发酵罐发酵生产抗生素

2．3．6 抗生素中试发酵工艺

2．4 结果与讨论

2．4．1 制霉菌素标准曲线的绘制

2．4．2 抗生素生产菌株的鉴定

2．4．3 发酵罐发酵生产抗生素的单因素优化方法

2．4．4 5L发酵罐发酵生产抗生素

2．4．5 抗生素发酵的工艺放大

2．5 本章小结

第三章 抗真菌代谢产物的分离纯化与结构鉴定

3．1 前言

3．2 实验仪器与材料

3．3 实验方法

3．3．1 抗真菌化合物的分离与鉴定

3．3．2 Bacilysin的大规模分离提取工艺研究

3．4 结果与讨论

3．4．1 抗真菌活性物质的分离与鉴定

3．4．2 Bacilysin的大规模制备工艺研究

3．5 本章小结

第四章 Bacilysin抑菌活性及药物动力学的研究

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 Bacilysin最低抑菌浓度(MICs)测定

4．2．2 Bacilysin急性毒性实验

4．2．3 Bacilysin体外肝代谢实验

4．3 结果与讨论

4．2．1 Bacilysin的体外抑菌试验

4．2．2 Bacilysin急性毒性试验

4．2．3 Bacilysin的体外肝代谢实验

4．4 本章小结

第五章 抗真菌化合物Bacilysin的抑菌机理研究

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 白色假丝酵母基因组提取

5．2．2 GlcN-6-P synthase基因的体外PCR、酶切与酶连

5．2．3 Bacilysin对葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlcN-6-P synmase)的抑制作用

5．2．4 Bacilysin对GlcN-6-P synthase的抑制作用研究

5．2．5 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlcN-6-P synthase)的模型构建

5．2．6 Bacilysin对葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlcN-6-P synmase)的抑制机理模拟

5．2．7 分子模拟抗菌肽的输送机理

5．3 结果与讨论

5．3．1 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlcN-6-P symase)的异源表达

5．3．2 Bacilysin对Gfa的抑制作用

5．3．3 PTR22转运蛋白的同源建模与模型评价

5．3．4 分子模拟抗菌肽的输送机里

5．3．5 分子模拟bacilysin与Gfa的作用机理

5．4 本章小结

第六章 Bacilycin前体氨基酸anticapsin的生物合成

6．1 前言

6．2 材料和方法

6．2．1 敲除质粒(pBAC-CE)的构建

6．2．2 解淀粉芽孢杆菌感受态的制备

6．2．3 敲除质粒电转化及其优化

6．2．4 抗真菌药物前体(anticapsin)的摇瓶发酵

6．2．5 Anticapsin的提取与分析方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 敲除质粒(pBAC-CE)的构建

6．3．2 pBAC-CE质粒转化与bacD基因敲除及其验证

6．3．3 工程菌产anticapsin的研究

6．4 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

附录

作者简介及博士期间的研究成果

参考文献