基于miRNA组学的生脉方及人参皂苷Rg3抗慢性心衰的作用机制研究

摘要

生脉方在临床上多用于治疗慢性心力衰竭、心律失常等心血管疾病。S型人参皂苷Rg3作为生脉方的活性化合物之一，其心肌保护机制尚有待深入研究。本论文应用miRNA组学技术研究生脉方及S型人参皂苷Rg3抗慢性心衰作用，在大鼠慢性心衰模型上发现生脉方和S型人参皂苷Rg3调控的差异miRNA，推测其作用靶点与潜在作用途径，在细胞模型上验证生脉方和S型人参皂苷Rg3的心肌保护作用，为阐释生脉方及其药效物质的作用机制提供依据。
　　主要研究成果如下:
　　1、采用miRNA芯片技术研究生脉方对慢性心衰大鼠心肌miRNA表达的影响，发现与模型组相比有16个差异miRNA，其中10个表达上调，6个表达下调。差异miRNA中包括与心肌肥大相关的miR-21-3p，与缺氧损伤相关的miR-294，与凋亡相关的miR-542-3p，采用RT-PCR技术对这些miRNA进行进一步验证。构建了差异miRNA的靶基因网络图，找出生脉方可能影响的信号通路与潜在的作用途径，并在细胞水平上验证了生脉方具有抗心肌细胞肥大和抗心肌细胞凋亡的作用。
　　2、采用miRNA芯片技术研究生脉方中的活性物质S型人参皂苷Rg3对心衰大鼠缺血心肌miRNA表达的影响，发现与模型组相比有14个差异miRNA，其中8个表达上调，6个表达下调。发现差异miRNA中有参与SIRT1调控的miR-200-5p，预测相关的靶基因及可能影响的通路，并以SIRT1为靶点进行深入研究。应用SIRT1活性检测荧光探针筛选生脉方中的活性化合物，发现12个具有SIRT1激动活性的化合物，其中7个来自人参，2个来自麦冬，3个来自五味子。研究人参皂苷类SIRT1激动剂的结构规律，发现母核为原人参二醇的人参皂苷类化合物具有较强的SIRT1激动活性，特别是人参皂苷20号碳的S构型对激动SIRT1起关键作用。以S型人参皂苷Rg3为代表性化合物，运用分子对接技术发现S型人参皂苷Rg3在底物多肽与SIRT1结合过程中起桥梁作用，从而增强蛋白与底物的结合能力。应用液相质谱联用、表面等离子共振等技术进一步验证S型人参皂苷Rg3的SIRT1激动活性，在AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型和t-BHP诱导细胞损伤模型上验证其心肌保护作用。
　　综上所述，本文研究了生脉方与S型人参皂苷Rg3对慢性心衰心肌组织miRNA表达谱的影响，发现生脉方具有抗心肌细胞肥大和抗心肌细胞凋亡作用，S型人参皂苷Rg3可通过激动SIRT1发挥保护心肌作用。研究结果阐明生脉方及其药效物质抗心力衰竭的作用机制提供了新的科学依据。

目录

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摘要

1 绪论

1．1 生脉方抗慢性心衰的研究进展

1．2 microRNA组学技术研究进展

1．3 中药药效物质研究进展

1．4 SIRT1的研究进展

1．4．1 SIRT1的生理活性

1．4．2 SIRT1与心肌保护

1．5 本论文研究内容

2 生脉方抗慢性心衰的microRNA组学研究

2．1 研究思路

2．2 材料与仪器

2．2．1 实验动物

2．2．2 细胞株来源

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 慢性心衰大鼠实验流程

2．3．2 miRNA芯片技术研究生脉方对心衰大鼠缺血心肌miRNA表达

2．3．4 差异miRNA的验证

2．3．5 生脉方抗心肌细胞肥大的验证

2．3．6 生脉方抗心肌细胞凋亡的验证

2．3．7 统计学分析

2．4 实验结果

2．4．1 生脉方对慢性心衰大鼠心功能的影响

2．4．2 慢性心衰模型的差异microRNA分析

2．4．3 生脉方抗慢性心衰的差异microRNA分析

2．4．4 生脉方抗慢性心衰的差异microRNA靶基因预测与通路分析

2．4．5 差异miRNA验证结果

2．4．6 生脉方抗心肌细胞肥大作用验证结果

2．4．7 生脉方抗心肌细胞凋亡作用验证结果

2．5 讨论与小结

3 S型人参皂苷R93抗慢性心衰的microRNA组学研究

3．1 研究思路

3．2 材料与仪器

3．2．1 细胞株来源

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 慢性心衰大鼠实验流程

3．3．2 miRNA芯片技术研究S型人参皂苷Rg3对心衰大鼠心肌miRNA表达

3．3．3 生脉方中SIRT1激动剂的筛选

3．3．4 SIRT1、多肽底物和S型人参皂苷Rg3的分子对接研究

3．3．5 应用液相-质谱联用方法验证S型人参皂苷Rg3的激动效应

3．3．6 表面等离子共振检测S型人参皂苷Rg3与SIRT1的亲和力

3．3．7 S型人参皂苷Rg3对细胞内SIRT1活性和NAD+／NADH比例影响

3．3．8 人参皂苷Rg3对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响

3．3．9 S型人参皂苷Rg3对t-BHP损伤的心肌细胞ATP和活性氧含量的影响

3．3．10 S型人参皂苷Rg3对心肌细胞呼吸速率的影响

3．3．11 RT-PCR法检测S型人参皂苷Rg3对心肌细胞mtDNA含量的影响

3．3．12 免疫共沉淀法测定S型人参皂苷Rg3对相关蛋白表达的影响

3．3．13 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 S型人参皂苷Rg3对慢性心衰大鼠心功能的影响

3．4．2 S型人参皂Rg3苷抗慢性心衰的差异microRNA分析

3．4．3 S型人参皂Rg3苷抗慢性心衰的差异microRNA靶基因预测与通路分析

3．4．4 生脉方中SIRT1激动剂的筛选

3．4．5 SIRT1、多肽底物和S型人参皂苷Rg3的分子对接研究

3．4．6 高效液相色谱-质谱联用技术验证S型人参皂苷Rg3激动SIRT1活性

3．4．7 表面等离子共振结果

3．4．8 S型人参皂苷Rg3对细胞内SIRT1活性与NAD+／NADH比例的影响

3．4．9 人参皂苷Rg3对AngⅡ诱导的心肌肥大的影响

3．4．10 S型人参皂苷Rg3对于细胞内ATP含量和活性氧水平的影响

3．4．11 S型人参皂苷Rg3对心肌细胞呼吸速率的影响

3．4．12 S型人参皂苷Rg3对mtDNA含量的影响

3．4．13 S型人参皂苷Rg3对相关蛋白表达的影响

3．5 讨论与小结

4 总结和展望

参考文献

作者简历