BCLB经AMPK-mTOR途径增强饥饿诱导的肝癌细胞凋亡及自噬

摘要

原发性肝癌是世界上发病率最高的癌症之一，预后极差，也是世界上第三位肿瘤性致死原因。近几年研究发现，肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）的表观遗传学调控变化，尤其是DNA甲基化改变，在原发性肝癌发生及进展中起到关键作用。
　　目的:通过高通量表观遗传学筛查，我们发现BCLB基因启动子在原发性肝癌中高度甲基化。因此，我们进一步探索该基因的功能，研究其在原发性肝癌发生和发展中起的作用及其机制。
　　方法:通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)和重亚硫酸氢盐全基因组测序(bisulfite genome sequencing，BGS)检测BCLB基因启动子的甲基化水平;通过逆转录cDNA PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和免疫组化(immunohistochemistry，IHC)检测肝癌组织和“癌旁正常”组织中BCLB的表达情况;通过转染pCMV6.BCLB质粒，筛选出稳定表达BCLB蛋白的肝癌细胞系，观察BCLB基因对肝癌细胞的迁移、凋亡、自噬等行为的影响，并通过在裸鼠皮下注射转染肝癌细胞，进一步观察BCLB基因对肝癌发生及生长的影响。
　　结果: BCLB基因在肝细胞性肝癌细胞系中以及原发性肝癌组织中表达水平下调甚至沉默，而这些表达降低或沉默的肿瘤细胞和肿瘤组织中，BCLB基因启动子均被检测到高度甲基化。105肝癌标本中，BCLB基因在47例(44.8％)癌组织中阳性表达;而在配对的癌旁正常组织中，有96例(91.4％)呈阳性表达，二者有显著性差异(p=0.04)。BCLB蛋白的表达与乙肝病毒感染(p=0.036)、甲胎蛋白水平(p=0.048)、肿瘤大小(p=0.006)以及肿瘤TNM分期(p=0.022)显著相关。癌组织中，BCLB阳性表达患者术后总体5年生存率以及无瘤生存率均显著高于阴性表达患者(p=0.032，p=0.027)。肝癌细胞株转染BCLB后，通过体内外试验发现，BCLB可显著抑制肿瘤生长。进一步研究发现，BCLB基因可通过AMPK-mTOR信号通路，促进饥饿诱导的肝细胞性肝癌的凋亡及自噬的发生。
　　结论:BCLB是一个肝癌抑癌基因， BCLB蛋白表达能显著抑制肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭，并能增强肝癌细胞对饥饿的敏感性从而通过MAPK-mTOR信号通路促进肿瘤细胞的凋亡和自噬。BCLB甲基化在肝癌中是一个经常发生的、肿瘤特异性的分子事件，甲基化的BCLB具有作为一个肿瘤标志物用于肝癌的诊断和预后评估的潜能。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语及中英文对照

1 引言

2 实验材料与实验方法

2．1 肝脏标本

2．2 实验所用细胞及细胞培养方法

2．3 实验动物及饲养

2．4 试剂和仪器

2．5 稳定表达BCLB的肝癌细胞株的建立

2．6 去甲基化药物(5-Aza)和去乙酰化药物(TSA)处理肝癌细胞

2．7 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

2．8 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)

2．9 细胞增殖能力检测

2．10 Transwell法检测细胞迁移能力

2．11 Invasion法检测肝癌细胞的侵袭能力

2．12 流式细胞仪检测法检测肝癌细胞凋亡

2．13 细胞免疫荧光实验

2．14 细胞自噬实验

2．15 流式细胞仪法检测BCLB对肝癌细胞周期的影响

2．16 Western Blot检测相关蛋白表达变化

2．17 免疫组化检测人组织标本BCLB表达情况

2．18 裸鼠皮下成瘤实验

2．19 裸鼠瘤体石蜡组织块制备及HE染色

2．20 统计分析

3 技术路线

3．1 BCLB基因在肝癌中的表达和甲基化水平检测

3．2 BCLB基因对肝癌细胞生物学功能的影响

4 结果

4．1 BCLB基因启动子在肝癌中高度甲基化

4．2 BCLB与肿瘤患者临床特征的相关性

4．3 BCLB转染过程和稳定细胞克隆株的验证

4．4 BCLB过表达后对肝癌细胞生物行为的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 Bcl-2家族蛋白在细胞自噬调节中的作用

作者简历及在学习期间所获得的科研成果