西藏野生大麦干旱耐性基因等位多态性分析及相关基因的功能鉴定

摘要

干旱胁迫是限制作物生产的主要气象灾害。研究作物耐/抗干旱胁迫机理，培育耐旱作物品种，提高作物抗旱能力，是作物生产急需解决的关键问题之一。青藏高原一年生野生大麦（Hordeum vulgare L.ssp.spontaneum和ssp.agriocrithum）（以下称西藏野生大麦）为我国独有的珍贵野生资源，具有丰富的遗传多样性，蕴藏着优异的抗逆等位基因，其在大麦品种改良上的潜在利用价值倍受国际大麦科学界的广泛关注。本研究以西藏野生大麦群体为材料，通过分析野生大麦的等位多态性，开发EST-SSR标记;利用覆盖全基因组的777个DArT标记对西藏野生大麦的耐旱相关性状进行全基因组关联分析，挖掘耐旱候选基因;采用拟南芥瞬时转化结合无损伤微电极离子流测定(MIFE，Microelectrode Ion Flux Estimation)技术对耐旱性状相关联的HvAKT1和HvHAK1基因进行功能分析。主要研究结果如下:
　　1.以80份西藏野生大麦基因型和16份栽培大麦基因型为材料，通过在线搜索大麦EST序列和SSR位点，设计引物进行PCR扩增，采用毛细管电泳分析系统分析等位多态性。共鉴定到具有多态性的69个SSR标记，包括49个EST-SSR和20个基因组SSR，由此检测到213个等位位点，平均每个标记含有3.14个等位位点。EST-SSR位点中三核苷酸重复序列最多，而基因组SSR主要是二核苷酸重复序列。基因组SSR较EST-SSR具丰富的多态性，西藏野生大麦比栽培大麦具更丰富的多态性。基于69个SSR标记进行的群体结构分析能够将西藏野生大麦和栽培大麦进行分离。序列比对结果表明其中47个含有SSR位点的EST序列与已知基因具有同源性。
　　2.以166份西藏野生大麦基因型为材料，分别进行水培空气干旱胁迫（根系悬空6 h/d，持续7d）及盆栽干旱胁迫（停止浇水持续30 d至土壤含水量4％）试验，分析野生大麦耐旱相关农艺性状的基因型差异，利用DArT标记进行全基因组关联分析。结果表明，干旱胁迫下植株的鲜重、干重、株高、根长、穗长、芒长、节间长和每穗粒重均表现显著的基因型差异，其中株高和芒长变异系数最小(8.4％)，每穗粒重变异系数最大(37.4％)。群体结构分析表明该自然群体可分为3个亚群，染色体LD衰退距离平均为5.16 cM，其中第6染色体上最小(0.03 cM)，第4染色体上最大(23.48 cM)。共检测到33个与野生大麦农艺性状关联的标记，其中与根干重相关的标记有11个，分别解释了9.8％～15.5％的表型变异，与地上部干重显著相关的标记bpb-3653可解释9.4％的表型变异。与株高和根长显著相关的标记分别有4个和2个，分别可解释9.1％～10.5％和8.9％～12.3％的表型变异。与芒长显著相关的标记共有14个，其中bpb-0068可解释19.8％的表型差异。另外，标记bpb-4184与芒长和节间长均显著相关，分别解释了12.4％和9.7％的表型变异。
　　3.研究了干旱胁迫对西藏野生大麦生理性状的影响及基因型差异，并利用DArT标记进行全基因组关联分析。结果表明，干旱胁迫对叶片POD和CAT活性、叶片MDA含量、叶片和根系H+K+-ATP酶活性、地上部和地下部钾离子含量、叶片可溶性蛋白含量的影响表现显著的基因型差异，其中尤其以根系H+K+-ATP酶活性基因型间差异最大，其次为叶片CAT活性和MDA含量，变异系数分别为75.9％、74.7％和71.6％，与对照相比增减率变幅分别为-93％～+256％、-66％～+599％和-80％～+351％。关联分析鉴定到22、2和14、2、4、10、3、1个DArT标记，分别与根系H+K+-ATP酶活性、K+含量和叶片CAT、POD、H+K+-ATP酶活性、K+、可溶性蛋白、MDA含量显著关联。其中与CAT活性显著关联的标记bpb-7069和bpb-7063解释的表型差异均达25.7％。同时，结果显示位于大麦染色体同一位置的标记可能与一个或多个性状相关联;标记bpb-5755(44.79 cM，2H)和bpb-4877(47.38 cM，2H)在染色体上的位置与大麦钾离子通道蛋白基因HvAKT1(45.5 cM，2H)和钾离子转运体基因HvHAK1(58cM，2H)相邻。
　　4.采用农杆菌介导的拟南芥瞬时转化及MIFE技术，测定PEG模拟干旱胁迫下拟南芥瞬时表达HvAKT1和HvHAK1植株根伸长区K+、H+、Ca2+和Cl-等的离子流。结果表明，干旱处理后，与拟南芥野生型Col-0以及农杆菌GV3101侵染的拟南芥植株相比，表达HvAKT1的植株K+吸收量显著增加，而表达HvHAK1的植株K+吸收量显著降低。对于H+而言，表达HvAKT1植株H+析出量与Col-0和GV3101没有显著差异，而表达HvHAK1植株H+析出量显著增加。与GV3101植株相比，表达HvAKT1植株Ca2+吸收量和C1-析出量显著降低，而表达HvHAK1植株Cd+吸收量和Cl-析出量显著增加。由上可知，表达HvAKT1的植株在干旱胁迫下主要是吸收K+，其次是吸收Ca2+，而表达HvHAK1的植株主要是吸收Ca2+，其次是吸收K+。利用HvHAK1-GFP、HvAKT1-GFP、HvHAK1-YFP和HvAKT1-YFP融合蛋白瞬时转化拟南芥进行亚细胞定位，结果表明HvHAK1和HvAKT1蛋白均位于细胞质膜上。研究结果为发掘西藏野生大麦耐旱相关基因和耐旱分子机制的研究提供了依据。

目录

声明

致谢

缩略词表

图表目录

摘要

第一章 文献综述

1．1．1 干旱胁迫对植物形态结构的影响

1．1．2 干旱胁迫对植物生理生化过程的影响

1．1．3 干旱胁迫对植物基因表达调控的影响

1．2 分子标记的开发及其在作物遗传研究中的应用

1．2．1 分子标记技术发展及特点

1．2．2 分子标记在作物遗传育种中的应用

1．3 全基因组关联分析及其在作物育种中的应用

1．3．1 多样性微阵列技术(DArT)

1．3．2 连锁不平衡

1．3．3 全基因组关联分析的方法及特点

1．3．4 全基因组关联分析在作物育种中的应用

1．4 西藏野生大麦种质资源的开发与利用

1．5 本研究的目的与意义

第二章 大麦EST-SSR和基因组SSR分子标记的开发和多态性特征

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与种植

2．1．2 PCR扩增和测序

2．1．3 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 西藏野生大麦的遗传多样性和SSR标记的特征

2．2．2 大麦种质亚群的划分和遗传关系

2．2．3 EST-SSR分子标记的功能注释

2．3 讨论

第三章 干旱胁迫下西藏野生大麦重要农艺性状的基因型差异及关联分析

3．1．2 水培试验

3．1．3 土培试验

3．1．4 群体结构和连锁不平衡分析

3．1．5 全基因组关联分析

3．2 结果与分析

3．2．1 干旱胁迫下西藏野生大麦农艺性状的基因型差异

3．2．2 西藏野生大麦群体结构和连锁不平衡程度

3．2．3 西藏野生大麦农艺性状相关的DArT标记

3．3 讨论

第四章 干旱胁迫下西藏野生大麦生理生化性状的基因型差异及关联分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料与试验方法

4．1．2 测定项目与方法

4．1．3 统计分析

4．2．1 干旱胁迫下西藏野生大麦抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的基因型差异

4．2．2 西藏野生大麦H+K+-ATP酶、钾元素含量和可溶性蛋白含量的基因型差异

4．2．3 西藏野生大麦抗氧化系统相关的DArT标记

4．2．4 西藏野生大麦H+K+-ATP酶相关的DArT标记

4．2．5 西藏野生大麦钾含量和可溶性蛋白含量相关的DArT标记

4．3 讨论

第五章 西藏野生大麦耐旱相关基因HvHAK1和HvAKT1功能分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 冻融法转化农杆菌

5．1．3 瞬时转化拟南芥

5．1．4 微电极离子流测定技术(MIFE)测定离子流

5．1．5 基因亚细胞定位

5．2 结果与分析

5．2．1 干旱胁迫对拟南芥瞬时表达株系以及野生型离子流的影响

5．2．2 HvHAK1和HvAKT1基因亚细胞定位

5．3 讨论

第六章 全文总结与展望

参考文献

附录