Haspin保护着丝粒区染色体粘连的分子机制研究

摘要

姐妹染色单体粘连(cohesion)由多亚基的黏连蛋白复合体(cohesin)所介导，并受到精确的调控以阻止染色体的错误分离。在有丝分裂前期和前中期，染色体臂上大量的cohesin被拮抗蛋白Wap1所去除，而着丝粒区的cohesin却仍然保留着以保证有丝分裂中期染色体正确整列。但是目前着丝粒区的cohesin是如何被保护而免受Wap1拮抗的分子机制还不甚清楚。
　　文中我们用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术构建了Haspin-KO细胞系。活细胞实验显示这些Haspin-KO细胞中有丝分裂进程变慢。研究发现Haspin-KO细胞中着丝粒区染色体粘连减弱，姐妹染色单体提前分离。细胞内和体外实验证实有丝分裂期蛋白激酶Haspin通过非激酶结构域氨基端保守的YGA/R基序(YGA/R motif)与cohesin调节亚基Pds5B结合。Haspin-Pds5B相互作用抑制Wap1与Pds5B结合。破坏细胞中内源或者外源Haspin与Pds5B的结合都会导致着丝粒区姐妹染色单体粘连减弱，以及姐妹染色单体提前分离。相反，把含有能与Pds5B结合的Haspin氨基端50个氨基酸定点带到有丝分裂期染色体着丝粒区或者在细胞中敲低Wap1都能恢复Haspin-Pds5B结合破坏的细胞中着丝粒区染色体粘连缺陷。在细胞中过量表达野生型Haspin抑制Wap1活性，染色体臂保留着大量cohesin，染色体臂闭合。而且，在过量表达野生型Haspin的细胞中即使敲低cohesion保护蛋白Sgo1也不会导致姐妹染色单体的提前分离。最后我们得出结论，Haspin通过与Pds5B结合竞争性地抑制Wap1的活性，从而保护着丝粒区姐妹染色单体粘连。
　　有丝分裂是生物繁殖和生长发育的基础，本项研究详细阐述了Haspin保护有丝分裂期着丝粒区姐妹染色单体粘连的分子机制，为进一步理解有丝分裂的调控机制提供了重要理论基础。

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摘要

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附表清单

缩写汇总

1 引言

1．1 Cohesin的结构

1．2 Cohesin环捕获和释放DNA的模型

1．3 Cohesin装载到染色体上介导姐妹染色单体粘连(cohesion)

1．4 有丝分裂期cohesin脱离染色体促使姐妹染色单体分离

1．5 蛋白激酶Haspin的研究进展

1．6 本研究的目的和意义

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 实验方法

3 实验结果

3．1 用CRISPR／Cas9介导的基因组编辑技术敲除Haspin造成细胞有丝分裂进程延滞

3．2 Haspin-KO细胞中着丝粒区染色体粘连减弱，姐妹染色单体提前分离

3．3 Haspin通过氨基端保守的YGA／R基序与Pds5B结合，抑制Wapl与Pds5B的结合

3．4 破坏Haspin与Pds5B结合导致着丝粒区染色体粘连减弱

3．5 包含YGA／R基序的Haspin氨基端能恢复Haspin-KO细胞中着丝粒区染色体粘连缺陷

3．6 Haspin-Pds5B结合破坏的细胞中敲低Wapl能恢复着丝粒区染色体粘连

3．7 过表达Haspin抑制Wapl的活性，且能替代Sgo1保护着丝粒区染色体粘连

4 讨论

5 结论

参考文献

作者简历及在校期间所取得的科研成果