OLA1抑制GSK-3β的活性维持小鼠脂肪含量稳定

摘要

研究目的:
　　Obg-like ATPase1(OLA1)是一种GTP酶，属于TRAFAC（翻译因子相关）类，Obg-HfIX超家族中的YchF亚群，具有水解GTP和ATP的活性，结合核糖体调节蛋白质翻译，在细胞信号转导、胞内运输、细胞应激及胚胎发育中起着重要作用。本课题组前期研究表明OLA1缺失可以引起小鼠不全性围生期死亡，仅约20％Ola1-/-小鼠得以存活，而这些小鼠成年后表现为“个头小”。本研究拟进一步分析并寻找成年小鼠“个头小”的原因，并通过建立组织特异性敲除小鼠的模型以便研究OLA1在特定组织器官中的功能。
　　研究内容和方法:
　　采用基因捕获及Cre-loxP技术分别建立Ola1基因全身及组织特异性敲除的小鼠（Ola1-/-、AKO），以野生型小鼠（Ola1+/+）为对照，观察基础状态及饮食诱导下小鼠表型的变化。采用原代培养方法建立小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF)，并用反相蛋白芯片技术(Reverse Phase Protein Assay，RPPA)从中筛选与OLA1相互作用的蛋白。结合Ola1-/-小鼠表型以及RPPA结果，筛选出相关分子并于细胞、组织水平验证。随后，我们将对OLA1调节相关靶蛋白功能的分子机制进行初步的探索。
　　研究结果:
　　前期我们课题组已经报道了Ola1全身敲除小鼠表现为胚胎发育迟缓及围生期高致死率，表明OLA1在生长发育中的重要作用。通过对成年小鼠的进一步分析发现:相比于野生型小鼠，Olal-/-小鼠仍表现为体型减小，各器官组织成比例减小，但脂肪组织减少更明显，尤其是白色脂肪组织，呈现明显“瘦”的表型。那么引起Ola1-/-小鼠白色脂肪组织减少的原因是OLA1影响了脂肪组织代谢，抑或是其他？于是我们从两个方面进行了验证。首先，我们采用Cre-loxp技术构建了Ola1基因脂肪组织特异性敲除(Adipose Tissue Specific Knockout，AKO)小鼠模型。与其对应野生型小鼠相比，在普通饮食及高脂饮食诱导下，AKO小鼠脂肪组织含量及相关代谢指标与野生型小鼠相比均无明显差异。这些结果表明OLA1不直接影响脂肪组织的代谢相关功能如脂肪组织新生，脂肪组织OLA1缺失不影响小鼠脂肪含量。另一方面，通过间接能量消耗测定、进食监测及小鼠认知行为相关实验，我们发现Ola1-/-小鼠能量消耗增加，进食减少，自主活动明显增加，认知记忆能力下降。据此，我们认为Ola1-/-小鼠脂肪组织含量减少的原因在于自主活动增加、进食减少所致的全身能量消耗增加。接着，我们利用RPPA技术比较了Ola1+/+与Ola1-/-MEF细胞中蛋白的差异性表达，发现GSK-3β的表达及活性在Ola1-/-MEF中明显增高。随后应用western blotting我们验证了在OLA1缺失或下调的细胞中及胚胎组织中GSK-3β蛋白水平及活性增高。同时IHC结果表明Ola1-/-小鼠的胚胎及成年脑组织中GSK-3β亦增高。Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β表达及活性增高可以导致其自主活动增加，进食减少，使全身能量代谢失衡，作为能量储存载体的脂肪组织含量减少。随后我们以MEF细胞为基本工具，应用qRT-PCR、polysomeprofiling分别从转录水平、翻译水平研究了OLA1对GSK-3β表达的调控，并结合放线菌酮追踪试验(CHX Chase Assay)评估OLA1对GSK-3β蛋白稳定性的影响，结果提示OLA1缺失后GSK-3β蛋白质稳定性增加进而引起蛋白水平上调。进一步，体外激酶抑制试验显示OLA1可以直接抑制GSK-3β的活性;免疫共沉淀结果表明OLA1和GSK-3β之间有直接的结合作用。综上所述，我们的研究首次阐明OLA1作为一种GTP酶，可以通过直接的相互作用促进GSK-3β的降解并抑制其活性。
　　结论与创新
　　1.在前期本课题组所报道的全身性Ola1基因敲除小鼠表型的基础上，本研究进一步发现了成年Ola1-/-小鼠的表型特征:作为能量存储载体的脂肪组织含量减少，呈现出明显“瘦”的体型。
　　2.本研究成功构建了floxed Ola1 E2小鼠品系（Ola1f/-），为研究Ola1基因在特定组织器官背景下的功能提供了基础，并且构建了脂肪组织特异性敲除小鼠品系—AKO小鼠。AKO小鼠表现为正常的围生期存活率，没有生长发育迟缓。AKO小鼠在普通饮食和高脂饮食诱导后，均未表现出脂肪组织含量的变化。这些结果表明OLA1在脂肪组织相关代谢过程中没有直接的作用。
　　3.本研究发现GSK-3β是OLA1作用的靶蛋白之一。OLA1可通过以下两种机制调节GSK-3β的活性:调节GSK-3β的稳定性影响其总蛋白水平;直接和GSK-3β相互作用抑制其激酶活性。通过阐明Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β活性过度升高而导致其自发活动增加，进食减少，全身能量消耗增加，从而发现了OLA1在机体能量代谢平衡中的间接作用。
　　4.本研究进一步为OLA1在肿瘤中的研究提供了基础。GSK-3β参与许多信号通路如Wnt信号通路从而，而Wnt信号通路与多种肿瘤相关如结直肠癌等。因此，GSK-3β可作为桥梁为研究OLA1与其他相关肿瘤发生发展的关系奠定基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

插图和附表清单

1 引言

2 构建Ola1基因全身敲除小鼠及表型分析

2．1 材料和仪器

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论和小结

3 构建Ola1基因脂肪组织特异性敲除小鼠及表型分析

3．1 材料和仪器

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论和小结

4 Ola1-／-小鼠白色脂肪组织减少的原因及相关分子机制

4．1 材料和仪器

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论和小结

5 OLA1调节GSK-3β活性的机制初探

5．1 材料和仪器

5．2 实验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论和小结

全文结论

参考文献

综述 GSK-3β：肿瘤中的两面性

作者简历及在学期间所取得的科研成果