维生素C通过激活蛋白激酶B抑制TGF-β信号通路改善糖尿病肾病的作用和机制研究

摘要

目的：
　　糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病引起的微血管慢性并发症之一，也是全球范围终末期肾病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的主要原因。由于糖尿病治疗方法的改进，病人生存时间的延长，使得糖尿病并发症发生率大为增加。DN发病机理到目前为止尚不明确，由血流动力学、代谢异常和血管活性物质之间的相互作用所导致的肾小球硬化和肾小管-间质纤维化在DN的形成与发展中起着至关重要的作用。尤以肾小球系膜细胞为主的细胞外基质增多为DN发病的主要原因。DN尚无特异的治疗药物，目前临床主要通过改善血糖、控制血压，例如应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体阻断剂可延缓肾病进展。在积极阐明DN发病机制的基础上，寻找DN的防治药物是一项迫切任务。
　　在糖尿病人和糖尿病实验动物模型中，由于高血糖和过氧化导致血清中维生素C(VC)浓度降低。因此，VC可能是改善DN的潜在药物。我们通过比较VC和维生素E（VE，对照）在改善DN中的作用，明确VC在治疗DN中的效应并明确抗氧化作用的地位，并探索其可能的作用机制。
　　方法和结果：
　　1.利用STZ诱导Gulo-/-小鼠，剥夺VC对DN的作用及可能的作用机制
　　人类自身无法合成VC，缺乏VC合成必需的酶：L-古洛糖酸内酯氧化酶(Gulo)。啮齿类大鼠和小鼠能自身合成VC，我们成功利用TALEN技术制作了L-古洛糖酸内酯氧化酶基因敲除的小鼠，补充VC（4g/L饮水中加入）完全可以纠正体内VC的缺乏状态。在Gulo-/-小鼠中，剥夺VC加重STZ诱导的蛋白尿，加重系膜扩张，并使肾小球α-SMA表达显著增加和细胞外基质累积。剥夺VC从形态和功能上加重肾小球的损伤。
　　2.利用STZ诱导SD糖尿病大鼠，补充VC和VE对改善DN的作用及可能的作用机制
　　利用STZ诱导的大鼠模型，补充VC和VE，确定VC的作用和特异性。补充VC显著降低STZ诱导的糖尿病大鼠尿蛋白，而VE却没有相似的作用。进一步通过肾小球滤过实验，肾小球重吸收实验和尿液渗透压实验，确定VC的作用靶部位是肾小球或肾小管。补充VC明显降低肌酐清除率（肾小球滤过率），而VE却没有相似的作用。补充VC和VE对肾小球重吸收和尿液渗透压均没有影响。补充VC使肾小球α-SMA表达显著降低和nephrin表达增加。补充VC不仅仅改善肾脏功能，并且抑制肾小球硬化，但是VE却没有相似的作用。
　　3.利用2型糖尿病db/db小鼠，补充VC和VE对DN的作用及可能的作用机制
　　我们利用2型糖尿病模型，db/db小鼠，补充VC和VE，确定VC的作用和特异性。补充VC显著降低糖尿病db/db小鼠模型的尿蛋白，但是VE却没有相似的作用。补充VC使肾小球α-SMA表达和细胞外基质累积显著降低，但是VE却没有相似的作用。
　　4.利用大鼠系膜细胞(Rat mesangial cells，RMCs)探索深层的分子机制
　　在大鼠系膜细胞模型中，VC提前给药作用16h后显著降低TGF-β1诱导的α-SMA，FN和COL4的mRNA水平，并且减少了Smad2的磷酸化水平。VC激活Akt，使Ski稳定性降低解除对Smad7的转录抑制，上调Smad7抑制TGF-β信号通路和细胞外基质的累积。在Gulo-/-小鼠模型中，进一步验证我们的实验结果，剥夺VC显著降低肾小球Smad7的表达，增加Ski的表达。
　　结论：
　　剥夺VC加重STZ诱导Gulo-/-小鼠的肾小球损伤;补充VC而不是VE，改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾小球纤维化;补充VC而不是VE，改善2型糖尿病db/db小鼠肾小球纤维化;VC可能通过Akt/Ski/Smad7信号通路抑制TGF-β，抑制系膜扩张和细胞外基质累积。VC可能通过抗炎作用而不是通过抗氧化机制改善DN，给予糖尿病患者VC补充是一个有效防治DN的治疗途径。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验仪器

2．2 实验材料与试剂

2．2．1 主要的试剂和耗材

2．2．2 抗体

2．2．3 细胞、菌株和质粒

2．2．4 实验动物

2．3 实验方法

2．3．1 模型的建立

2．3．2 分组和给药

2．3．3 指标

2．3．6 肾小管重吸收实验

2．3．7 总RNA的提取

2．3．8 第一链cDNA的合成

2．3．9 荧光实时定量PCR

2．3．10 细胞总蛋白提取

2．3．11 蛋白免疫印迹

2．3．12 HE，PAS和MASSON染色

2．3．13 电镜

2．3．14 细胞株的培养及其传代

2．3．15 细胞的冻存

2．3．16 细胞的复苏

2．3．17 细胞的SiRNA转染

2．3．18 3TP-lux双荧光素酶报告基因的检测

2．3．19 细胞浆蛋白与细胞核蛋白的抽提

2．3．20 统计分析

3．结果

3．1．1．剥夺VC加重STZ-诱导的Gulo-／-小鼠肾功能不全

3．1．2．剥夺VC加重STZ-诱导的Gulo-／-小小鼠肾脏肥大

3．1．3．剥夺VC加重STZ-诱导的Gulo-／-小鼠肾小球形态学的损伤

3．1．4．剥夺VC加重STZ-诱导的Gulo-／-小鼠肾小球细胞外基质累积

3．2．补充VC改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏纤维化

3．2．2．补充VC在STZ诱导的糖尿病大鼠的作用靶部位

3．2．3．补充VC在STZ诱导的糖尿病大鼠的作用靶细胞

3．3．补充VC改善db／db小鼠的肾脏纤维化

3．3．1． 补充VC减少db／db小鼠的尿蛋白

3．3．2．补充VC在db／db小鼠的作用靶细胞

3．4．VC通过Akt／Ski／Smad7通路抑制细胞外基质累积

3．4．2．VC抑制TGF-β1诱导的p-Smad2磷酸化

3．4．3．VC上调Smad7的mRNA和蛋白水平

3．4．4．剥夺VC降低肾小球Smad7的表达

3．4．5．VC下调Ski的蛋白水平

3．4．7．VC激活蛋白激酶B(Akt)

3．4．9．VC降低Ski的稳定性和促进Smad7的表达

3．4．10．剥夺VC在STZ诱导的Gulo-／-小鼠鼠中Ski的表达

4．讨论

5．结论

参考文献

综述：糖尿病肾病

作者简介及所取得的科研成果和奖励