Src通过磷酸化Lats1抑制Hippo信号通路的机制与功能研究

摘要

Hippo信号通路是在果蝇中通过嵌合体筛选时发现的调控器官大小的信号途径。它的组分和功能在哺乳动物中也高度保守。在Hippo信号通路中，Mst1/2激酶在它的支架蛋白Sav1辅助下磷酸化Lats1/2激酶，磷酸化的Lats1/2在与Mob的相互作用中被进一步活化，进而磷酸化并抑制YAP。YAP是Hippo信号通路关键的效应分子。它作为转录辅激活因子和TEAD家族转录因子相互作用从而促进基因的转录表达。Hippo信号通路受多种上游信号如机械力、细胞极性、细胞骨架信号、G蛋白偶联受体信号等调控。Hippo信号通路调控细胞增殖、细胞凋亡和干细胞的自我更新，因此在控制器官大小方面有着重要作用。在动物模型中，Hippo信号通路失活引起器官的异常增大并伴随肿瘤的发生。更重要的是，在很多人类癌症中发现了Hippo信号通路的异常，但目前失调的机制还不是很清楚。本研究发现了在细胞黏着条件下Lats1受调控的一种新机制。我们发现细胞与基质的黏着诱导Lats1蛋白的酪氨酸磷酸化修饰。通过酪氨酸激酶文库的筛选，我们发现Src作为一个酪氨酸激酶能够在多个位点上直接磷酸化Lats1。这一方面导致Mob结合的减弱，另一方面引起激酶结构域中底物结合区结构的改变，因此Lats1的活性受到抑制。细胞与基质的黏着能够部分通过Src介导的磷酸化抑制Lats1，激活Hippo信号通路效应分子YAP。我们还发现Src的激活抑制了Lats1的抑癌基因功能，因此促进肿瘤细胞贴壁非依赖性生长。而且Src诱导的成纤维细胞癌症转化和肿瘤生长依赖于YAP活性。更重要的是我们通过癌症组织芯片的免疫组织化学染色发现在人乳腺癌中Src的蛋白水平和去磷酸化的活化YAP的积累呈正相关关系。这些发现揭示了Src对Lats1的酪氨酸磷酸化是细胞黏着调控Hippo信号通路的新机制，并提示Src的激活对于肿瘤发生中YAP的失调起关键作用。这一发现为进一步阐明Hippo信号通路在癌症中失调的机制和开发靶向治疗方案提供了新的思路。

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摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 Hippo信号通路的组成

1．2 Hippo信号通路的生物学功能

1．2．1 Hippo信号通路调控器官大小

1．2．2 Hippo信号通路调控组织再生与干细胞自我更新

1．2．3 Hippo信号通路调控癌症发生

1．3 Hippo信号通路的调控机制

1．3．1 极性和连接蛋白调控Hippo信号通路

1．3．2 机械力调控Hippo信号通路

1．3．3 GPCR调控Hippo信号通路

1．3．4 磷酸化对YAP的调控

1．4 Src蛋白的结构与调控

1．4．1 Src蛋白的结构

1．4．2 调控Src蛋白的机制

1．5 Src在肿瘤中的生物学功能

1．5．2 Src影响细胞粘附，运动和侵袭

1．5．3 Src与癌症转移

1．5．4 Src影响血管生成

1．5．5 Src作为药物治疗靶点

2．1．3 质粒

2．1．4 抗体

2．1．5 shRNA序列

2．1．6 RT-qPCR引物序列

2．1．7 主要仪器

2．1．8 主要试剂

2．1．9 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞转染和细胞感染，构建稳转细胞系

2．2．4 免疫印迹

2．2．5 免疫共沉淀

2．2．6 免疫荧光

2．2．7 体外激酶活性实验

2．2．8 RNA的提取，逆转录与实时荧光定量PCR

2．2．9 荧光素酶报告基因实验

2．2．10 细胞组分分离

2．2．11 软琼脂克隆形成实验

2．2．12 克隆形成实验

2．2．13 裸鼠荷瘤实验

2．2．14 免疫组化

第三章 Src通过磷酸化Lats1抑制Hippo信号通路的机制与功能研究

3．1 激酶文库的构建

3．2 细胞黏着诱导Lats1酪氨酸磷酸化修饰

3．3 筛选Lats1的上游酪氨酸激酶

3．4 Src直接磷酸化Lats1

3．5 Src抑制Lats1的活性

3．6 Src在多个位点磷酸化Lats1

3．7 细胞黏着通过Src抑制Hippo信号通路

3．8 Src抑制Lats1的抑癌基因功能

3．9 YAP对Src诱导的肿瘤发生起重要作用

3．10 在人类乳腺癌中Src蛋白水平和YAP激活相关

3．11 小结

3．12 讨论

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果