猪链球菌2型：5型弱毒株交叉保护性与类Ⅳ型分泌系统在致病中的作用机制

摘要

猪链球菌（Streptococcus suis，S.suis）是重要的人兽共患病原菌，在世界范围内均有分布。该菌可通过呼吸道及黏膜途径感染人畜引起败血症、心内膜炎、关节炎及脑膜炎等临床病症。猪链球菌病是养猪业中严重的细菌性传染病之一，由病死猪传染给人可导致公共卫生事件。中国于1998年与2005年先后两次暴发人感染猪链球菌2型（S.suis2）的群体事件，累计引起52人死亡，其中链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)患者死亡最多(占96.2％)。这些患者病程通常只有1-2d，临床主要表现为急性高热、低血压、弥散性血管内凝集与多脏器功能衰竭，不同于以往的缓和性的猪链球菌感染。研究发现国内暴发的这两次猪链球菌2型分离株为强毒ST7型菌株，含有独特的89K致病岛。疫苗是预防多种猪病的重要措施之一，但猪链球菌疫苗开发研究缓慢，现有的猪链球菌疫苗存在接种剂量大、免疫效果不稳定与对其它非2型感染性猪链球菌强毒株交叉保护性差等缺陷。
　　本课题旨在:(1)筛选获得可对流行率较高的S.suis2与S.suis9两种血清型强毒株提供较好交叉免疫保护的弱毒活疫苗候选菌株;(2)阐明猪链球菌2型类Ⅳ型分泌系统(T4SS)virD4基因在SS2致病中的作用;(3)VirD4介导的肽酰脯氨酰折叠酶PrsA诱导细胞死亡的机制。
　　1.猪链球菌5型XS045活疫苗候选株对2型与9型强毒株感染提供交叉保护
　　通过黏附感染与血清学分析获得1株高黏附力5型XS045候选株（黏附率达26.7％），致病性与毒力基因筛查结果显示该菌株对上皮细胞毒性小，对小鼠、斑马鱼与仔猪致病性均较低，菌株先天缺失Suilysin、MRP与DltA等毒力因子，含有已报道的S.suis大部分免疫原性蛋白。XS045活菌在小鼠体内定植能力较强，可在血液与脏器中持续存在两周以上，安全性较好。小鼠模型免疫保护试验结果显示XS045活菌免疫原性较好，可诱导机体产生高滴度的抗体（加强免疫后血清效价达1∶25600），免疫小鼠可抵抗致死剂量的S.suis2型（HA9801）与S.suis9型(JX13)强毒菌株的感染，保护率分别为100％与85％。黏附拮抗、全血杀伤、吞噬调理与抗体结合能力检测发现XS045活菌免疫对HA9801与JX13菌株感染提供交叉保护的可能机制是该菌包含有这两株强毒细菌共有表面抗原，XS045高免血清与S.suis2型与S.suis9型菌株表面蛋白反应性较强，可有效结合S.suis2与S.suis9全菌;高免血清预处理的S.suis2型与S.suis9型菌体对上皮细胞HEp-2黏附力下降，更易于被吞噬细胞或全血吞噬与清除。这说明XS045免疫后有效诱导机体产生交叉调理作用的抗体是抵抗S.suis2型与S.suis9型强毒株感染的可能原因之一。
　　2.猪链球菌2型类Ⅳ型分泌系统关键因子VirD4氧化应激后可诱导PrsA等蛋白差异分泌
　　同源重组法构建猪链球菌2型HA9801的T4SS同源蛋白VirD4与VirB4基因缺失株，VirD4参与细菌毒力，具有抗吞噬作用，VirD4突变株更容易被不同来源的吞噬细胞所吞噬，其中以骨髓源巨噬细胞(BMDM)最明显，吞噬量是亲本株的3倍。体内体外感染试验证实VirD4参与S.suis2型菌株的早期致炎反应，缺失突变株感染致宿主炎症因子分泌显著下调。过氧化氢体外刺激与RAW264.7细胞模型证实氧化应激可分别使VirD4转录水平上调55.3与9.8倍;对过氧化氢应激后亲本菌株与VirD4突变株的培养上清分别进行蛋白质双向电泳与差异蛋白质谱鉴定，结果发现亲本株与VirD4突变株分别有33个与148个差异在1.5倍以上的分泌蛋白;其中亲本株丰度较高且上调差异在3倍以上的分泌蛋白有3个，包括肽酰脯氨酰折叠酶PrsA(Parvulin-like peptidyl-prolyl isomerase);VirD4突变株中明显上调的则有7个。这些蛋白大多为多功能蛋白，可能在DNA损伤修复、核酸代谢、糖代谢、应激调控与细菌致病性中扮演重要作用，差异蛋白在转录水平得到验证，这为进一步分析T4SS效应因子的功能提供了基础。
　　3.PrsA可诱导细胞死亡并刺激细胞释放炎症因子
　　体外原核表达与纯化猪链球菌2型T4SS相关差异分泌蛋白PrsA，体外刺激小鼠bEND3.0与RAW264.7细胞后发现PrsA因子具有剂量（10-100μg/ml）与时间依赖的细胞毒性与致炎效应，且致细胞死亡作用与细菌溶血素样因子的穿孔机制无关;经自噬、凋亡、焦亡与坏死等细胞死亡方式鉴定发现PrsA主要引起细胞焦亡，并伴随坏死性凋亡，细胞焦亡相关抑制剂Ac-YVAD-cmk(100μM)可以明显缓解该蛋白引起的细胞死亡。体外截短表达PrsA不同区域蛋白:PrsA折叠酶功能域PPIase、包含PPIase的N端结构域截短蛋白片段(NP)以及包含PPIase的C端结构域截短蛋白片段(PC)，分别刺激小鼠bEND3.0与RAW264.7细胞发现N端与C端结构域为PrsA诱导细胞死亡所必需，折叠酶酶学催化结构域PPIase并不主导PrsA的细胞毒性与致炎效应;通过RNA干扰tlr2和myd88，发现TLR2不是PrsA的模式识别受体，TLR2-MyD88途径不参与PrsA诱导的细胞死亡。上述研究为猪链球菌PrsA在猪链球菌致病中的机理奠定了基础。
　　综上所述:本研究首次报道获得了可对强毒猪链球菌2型与9型菌株提供交叉保护力的XS045活疫苗候选株;证明猪链球菌2型类Ⅳ型分泌系统关键蛋白VirD4介导细菌的致病性，氧化应激可显著上调其表达，可能参与PrsA等因子的分泌;PrsA可以诱导炎症因子释放，并主要通过焦亡途径诱导细胞死亡。本研究结果为深入探究猪链球菌2型致病机制与辅助临床疫苗的开发提供了基础。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

一、猪链球菌疫苗研究进展

1 猪链球菌概况

2 猪链球菌疫苗开发研究进展

1 猪链球菌毒力因子

2 猪链球菌致病机理研究进展

3 猪链球菌中毒性休克综合征

三、本研究拟探索的科学问题

第二部分 试验研究

第一章 猪链球菌弱毒株筛选与交叉免疫保护作用

1 引言

2 技术路线

3 材料与方法

4 试验结果

5 分析与讨论

第二章 类Ⅳ型分泌系统在猪链球菌2型致病中的作用研究

1 引言

2 技术路线

3 材料与方法

4．试验结果

5 分析与讨论

第三章 类Ⅳ型分泌系统相关差异分泌蛋白PrsA的生物学功能

1 引言

2 技术路线

3 材料与方法

4 试验结果

5 分析与讨论

全文结论

创新点

展望

缩略词表

参考文献

作者简介

致谢