S.aureus机械敏感离子通道MscL跨膜区域关键位点的研究

摘要

背景:
　　大电导的机械敏感离子通道Mechanosensitive channel of Large conductance(MscL)是位于细菌的细胞膜上的一类机械敏感性通道，可以感受膜张力的变化而开放，其生理功能是作为“紧急释放阀”在细菌经历剧烈的渗透压改变时开放并释放内容物而使细菌存活下来。MscL在细菌界普遍存在，不同细菌上的MscL的氨基酸序列相似性也非常高，但MscL在哺乳动物和人类基因组上并不存在。MscL没有离子选择性，它只是根据离子或者分子的大小来判断其是否能通过。MscL完全开放的时候电导大约3.2 nS，孔道直径能达到30(A)左右，离子、小分子，甚至小的蛋白质都可以通过，因此MscL是一种较好的药物靶标。
　　目的:
　　本实验中，我们通过分析S.aureus（Staphylococcus aureus，金黄色葡萄球菌）MscL TM1（the first transmembrane，第一跨膜区域）上的氨基酸位点在通道不同构象时与水的可接触性，筛选鉴定能够影响通道活性的重要氨基酸位点，以便MscL作为靶标而设计药物分子提供依据。
　　材料与方法:
　　1.在本实验中，我们采用SCAM(the substituted cysteine accessibility method，半胱氨酸取代法)，将S.aureus MscL TM1的三十个氨基酸位点突变为半胱氨酸，得到三十个对应的S.aureus MscL突变体。
　　2.在MJF465菌株中，将三十个S.aureus MscL进行渗透休克处理，并用MTSET与之作用，观察细菌的生长情况并记录、分析。
　　结果与讨论:
　　1.通过本实验，发现S.aureus MscL A20C、V21C、G24C这三个突变体在通道关闭时隐藏于脂质中，通道开放时暴露于水环境中，并且在结合MTSET试剂后通道活性明显增强，具有很强的GOF(gain of function，功能增强)表型。
　　2.而且，发现S.aureus MscL G12C、D16C、L17C、A18C、I19C、A26C、K29C、S33C、L34C这九个突变体也在通道关闭时隐藏于脂质中，通道开放时处于水环境中。
　　3.此外，发现S.aureus MscL V14C、V22C、M23C、A25C、F27C、N28C、I30C、I31C、S32C、V35C、E36C、N37C、I38C、I39C与M40C这十五个突变体失去了MscL的生理功能，成为了无功能突变体。
　　4.通过实验研究，我们初步分析了S.aureus MscL TM1的氨基酸的构象变化，希望能为药物分子的设计提供一些理论依据。

目录

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致谢

摘要

缩略词表

1 引言

2．1 菌株与质粒

2．2 PCR引物

2．3 主要试剂

2．4 主要仪器

3 方法

3．1 PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)

3．2 Dpn Ⅰ酶消化模板DNA

3．3 PCR产物的纯化

3．4 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)

3．5 转化DH10β

3．6 重组质粒的提取

3．7 序列的鉴定

3．8 转化MJF465

3．9 细胞活性实验

4 实验结果

4．1 S．aureus MscL的结构与序列信息

4．2 S．aureus MscL增强MJF465在Shock处理下的存活能力

4．3 S．aureus MscL TM1的LOF突变体

4．3．2 Osmotic shock处理下TM1半胱氨酸突变体的存活率分析

4．4 S．aureus MscL TM1的功能(Functional)突变体

4．4．1 Shock+MTSET处理下功能突变体的存活率分析

4．4．2 MTSET对TM1功能突变体的影响

4．5 S．aureus MscL TM1的半胱氨酸突变体分类

5 讨论

参考文献

综述 MscL与抗生素的相互作用及其潜在用途

个人简历