Sterile-20激酶MINK1调控血小板功能并参与止血和血栓形成的机制研究

摘要

血小板在生理止血和血栓形成中扮演了重要角色，血小板的功能不足会导致出血，而血小板过度活化则会引起血栓性疾病。因此对血小板活化分子机理的深入研究，能够阐明出血或血栓性疾病的发病机制，并为该类疾病寻求新的治疗靶点和策略。在血小板活化过程中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)作为重要的信号通路节点分子，参与调控血小板粘附、释放、聚集等各项功能，以促进血栓的形成。经典的MAPK通路是包含三个激酶的级联信号反应，MAP3K磷酸化激活MAP2K，MAP2K再磷酸化激活MAPK。然而，在血小板信号网络中对MAPK通路具体的细致调控还不清楚。以往研究表明，Sterile-20激酶在信号通路中能够扮演MAP4K的角色来调控MAPK通路的活化。Sterile-20激酶超家族根据结构可分为两大家族:p21活化激酶(PAK)家族和生发中心激酶(GCK)家族。MINK1属于GCKⅣ亚家族，在2000年被首次报道，在多种细胞活动过程中发挥重要作用，并能够作为MAP4K参与调控Ras致癌基因诱导的卵巢上皮细胞生长抑制以及T细胞发育过程中的阴性选择。MINK1在止血与血栓领域的作用在此之前未见报道，鉴于MAPK通路在血小板活化以及血栓形成中的作用，我们提出假设:MINK1能够通过调控MAPK来介导血小板活化，并参与止血和血栓形成过程。
　　本研究利用转基因小鼠模型，首次研究了MINK1在血小板功能，止血以及血栓形成中的作用。结果可以概括为以下几点:
　　(1)在小鼠出血实验中，MINK1敲除小鼠尾部出血时间明显延长，说明MINK1的缺失使得小鼠止血功能受损。
　　(2)在三氯化铁诱导的肠系膜动脉血栓模型中，MINK1敲除小鼠的动脉堵塞时间显著延长，两倍于野生型小鼠。我们通过体外全血微灌流实验模拟血栓形成，发现动脉流速条件下，MINK1缺失血小板在胶原表面形成的血栓面积明显减小，证明MINK1对血栓形成的正向促进作用依赖于其在血小板中发挥的作用。
　　(3)在对血小板各项功能进行检测后发现，MINK1的缺失不影响血小板在胶原表面的粘附，然而当用低浓度胶原和凝血酶刺激血小板发生聚集时，MINK1的缺失使得血小板的聚集水平显著降低，并且伴随有致密颗粒的释放障碍，但是血小板α颗粒的释放以及血栓烷A2的合成并不受MINK1缺失的影响。另外，MINK1缺失血小板在纤维蛋白原表面的铺展面积较野生型血小板明显减小，但是其血块回缩功能则表现正常。
　　(4)当继发释放的ADP被apyrase水解后，野生型血小板与MINK1缺失血小板在聚集和铺展功能上的差异基本消失，并且，外源性补充ADP能够使MINK1缺失血小板的聚集和铺展功能恢复到正常水平。因此，MINK1的缺失导致的ADP分泌减少是血小板聚集和铺展功能发生障碍的原因。
　　(5)在分子机制研究方面，我们发现MINK1的缺失不影响整合素αⅡbβ3的由内向外和由外向内信号本身，而在低浓度胶原和凝血酶所诱导的聚集反应中，MINK1的缺失使得ERK，p38和Akt的磷酸化水平显著降低，且MINK1对上述分子的调控不依赖于继发释放的ADP以及整合素αⅡbβ3介导的由外向内信号。进一步研究发现，MINK1也能够调控ERK和p38上游的MAP2K分子—MEK1/2和MKK3/6的活化。在用ERK抑制剂U0126或p38抑制剂SB203580孵育血小板后发现，它们能够消除野生型血小板与MINK1缺失血小板在应对低浓度胶原和凝血酶刺激时聚集和致密颗粒释放上的差异，说明MINK1缺失导致的ERK和p38磷酸化水平的降低，是致密颗粒释放减少以及聚集受损的原因。
　　综上所述，MINK1是参与血小板活化以及止血和血栓形成的新信号分子，其能够通过介导MAPK通路以及Akt的活化，来特异调控致密颗粒的释放。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

1．引言

2．1 实验对象

2．2 主要实验器材

2．3 抗体及相关试剂

2．4 主要实验试剂的配制

2．5 实验方法

3．实验结果

3．2 MINK1敲除小鼠止血功能发生障碍

3．3 MINK1敲除小鼠血栓形成发生障碍

3．4 MINK1的缺失导致血小板的聚集功能和致密颗粒释放发生障碍

3．6 MINK1缺失导致的ADP释放减少是血小板聚集受损的原因

3．7 MINK1的缺失导致血小板铺展功能发生障碍

3．8 MINK1的缺失不影响血小板的血块回缩功能

3．9 MINK1的缺失不影响血小板整合素αⅡbβ3的活化

3．10 MINK1的缺失导致血小板ERK，p38和Akt磷酸化水平降低

3．11 MINK1的缺失对血小板MAP2K和MAP3K磷酸化水平的影响

3．12 MINK1缺失导致的ERK和p38活化水平的降低是血小板聚集受损的原因

4．讨论

5．结论

参考文献

综述 血小板仅颗粒和致密颗粒释放的作用及机制

作者简历及在学期间所取得的科研成果