非ATP竞争结合机制抑制BCR/ABL在CML中的治疗作用研究

摘要

本文分为以下两个部分进行探讨：
　　第一部分 新型小分子药物JNJ-165抑制T315I突变BCR/ABL的机制及其临床应用价值研究
　　目的:
　　前期研究已发现JNJ-165具有不依赖p53下调非突变BCP/ABL的表达，具有明显的抗CML作用。本博士课题在前期的基础上进一步研究JNJ-165对突变BCR/ABL（包括T315I位点突变）的降解作用及其在TKIs耐药CML中的杀伤作用，并且从启动子、翻译、蛋白质降解等水平研究其下调BCR/ABL的具体机制。
　　方法:
　　采用MTT法及集落培养法检测JNJ-165对BCR/ABL突变的CML细胞株及原代细胞生长抑制作用;western blot法检测BCR/ABL及其下游蛋白的表达情况;用Real-Time PCR检测法及双荧光素酶报告基因检测法，从启动子及基因水平研究JNJ-165对BCR/ABL的影响;western blot检测蛋白酶体抑制剂MG132、蛋白质合成抑制剂CHX和caspase-3抑制剂作用后BCR/ABL及其下游蛋白水平的变化，并通过免疫共沉淀法检测JNJ-165作用后BCR/ABL泛素化水平的改变，从蛋白质水平研究JNJ-165对BCR/ABL及其下游通路的影响;应用集落培养观察JNJ-165对正常骨髓细胞的生长抑制作用及集落克隆的影响;构建K562细胞和32D-p210-T315细胞荷瘤小鼠模型，观察及比较单用JNJ-165、单用TKIs和JNJ-165联合TKIs对小鼠瘤体生长抑制作用及小鼠生存期的影响，并且western blot检测瘤体BCR/ABL水平的变化;应用SPSS16.0软件统计分析，ANOVA和Student's t检验分析组之间的差异，如p＜0.05则认为具有统计学差异。
　　结果:
　　1.JNJ-165可以抑制CML细胞株(32D-p210、32D-p210-T315I)及原代患者细胞生长，呈浓度依赖性，对正常细胞株无明显毒性作用。2.JNJ-165并不影响BCR/ABL启动子的表达，但能明显抑制CML细胞(WT、T315I-MT) BCR/ABLmRNA的表达。3.蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转JNJ-165对BCR/ABL的降解作用，JNJ-165处理组BCR/ABL泛素化水平明显升高，表明JNJ-165能够通过泛素化-蛋白酶体途径降解BCR/ABL。4.JNJ-165能上调抑癌基因PP2A的表达，后者通过上调SHP-1蛋白而使BCR/ABL蛋白去磷酸化，去磷酸化的BCR/ABL不稳定，使其容易被泛素化，进一步被蛋白酶体降解。5.成功构建了K562细胞和32D-p210-T315细胞荷瘤小鼠模型。体内实验表明，在K562细胞荷瘤模型中，JNJ-165能抑制瘤体生长并和TKIs具有明显的协同作用;而在32D-p210-T315细胞荷瘤模型中，TKIs对瘤体生长无抑制作用，也不能延长小鼠的生存期，而单用JNJ-165能够明显抑制瘤体生长并延长小鼠的生存时间。6.瘤体组织提取蛋白行western blot检测，结果表明，与TKIs相比，JNJ-165更明显的下调瘤体内BCR/ABL及下游通路的蛋白。
　　结论:
　　通过体内外的一系列分子生物学方法，证实了小分子抑制剂JNJ-165通过激活PP2A/SHP-1通路使得BCR/ABL去磷酸化，去磷酸化的BCR/ABL不稳定，最终通过被泛素化-蛋白酶体途径降解，其下调BCR/ABL的作用机制并不同于TKIs，为非ATP竞争结合性机制。通过荷瘤模型实验，表明JNJ-165在体内同样可以通过下调BCR/ABL的表达而起到抗CML的作用。因此，JNJ-165通过非ATP竞争结合性机制抑制BCR/ABL，为TKIs耐药的CML提供了新的治疗策略，能提高TKIs耐药CML患者的疗效并改善预后，具有重要的理论意义和应用前景。
　　第二部分 新型溶瘤腺病毒SG511-BECN对多重耐药CMLBCR/ABL的抑制作用及其机制研究
　　目的:
　　前期研究已表明携带beclin-1自噬基因的新型溶癌腺病毒SG511-BECN具有明显的抗AML作用。本博士论文进一步研究和比较SG511-BECN、SG511和化疗药物对多重耐药CML细胞株K562-A02杀伤作用的差异及其与beclin-1基因诱导自噬的相关性;初步探讨SG511-BECN诱导CML发生自噬与活性氧物质(reactiveoxygen species，ROS)产生的相关性机制;探讨SG511-BECN与传统化疗药物多柔比星(Dox)协同抑制K562-A02的作用及机制;研究SG511-BECN诱导CML细胞高表达beclin-1对BCR/ABL基因及蛋白表达的影响;在此基础上，对文献的系统学习，完善并形成自噬与免疫、自噬溶酶体途径与内吞外泌体通路相互关系等理论体系，为进一步深入研究做好准备。
　　方法:
　　MTT法检测SG511-BECN对K562-A02生长抑制作用;荧光显微镜观察自噬荧光小体;透射电镜观察细胞内自噬小体及腺病毒分布;AV/PI流式术检测SG511-BECN作用后CML细胞的凋亡情况;western blot检测SG511-BECN作用后CML细胞凋亡蛋白和自噬相关蛋白的表达情况;应用siRNA技术沉默ATG5和ATG7自噬相关蛋白后，观察SG511-BECN对CML细胞抑制作用的改变;ROS试剂盒检测SG511-BECN作用下CML细胞ROS水平的变化;应用Tiron、NAC抑制ROS的产生，此时观察SG511-BECN诱导CML自噬水平和其杀伤活性的改变;流式细胞术检测化疗药物Dox作用下腺病毒SG511-EGFP的感染效率变化;Real-time PCR及western blot检测BCR/ABL mRNA和蛋白表达的变化;激光共聚焦观察BCR/ABL和beclin-1蛋白在CML细胞内定位情况;应用SPSS16.0软件统计分析，ANOVA和Student's t检验分析组之间的差异，如p＜0.05则认为具有统计学差异。
　　结果:
　　1.新型溶瘤腺病毒SG511-BECN较SG511对CML更具有杀伤作用，并且这种杀伤作用不被pan-caspase抑制剂所逆转;2.SG511-BECN作用后，CML细胞caspase家族蛋白无明显激活，AV/PI流式也未检测到明显凋亡，而自噬相关蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ的表达明显增强;荧光显微镜、电镜观察到明显自噬荧光小体和自噬小体。3.siRNA技术沉默ATG5或ATG7自噬相关蛋白后，可明显逆转SG511-BECN对CML的杀伤作用。4.SG511-BECN诱导CML发生自噬的过程中伴随着ROS的产生，而抑制ROS产生也能下调SG511-BECN诱导的自噬水平。5.传统化疗药物Dox能够通过增强SG511-BECN的感染效率而起到联合抗CML作用。6.SG511-BECN能从基因及蛋白水平抑制CML细胞BCR/ABL的表达。7.激光共聚焦观察到BCR/ABL和beclin-1蛋白在胞内具有共定位现象。8.电镜下SG511-BECN处理组较SG511处理组在胞浆及胞核内观察到更多的病毒聚集。
　　结论:
　　新型溶瘤腺病毒SG511-BECN能够通过靶向自噬途径并下调BCR/ABL的表达而起到对K562-A02明显杀伤作用。并且传统化疗药物Dox能够通过增强SG511-BECN的感染效率而起到联合抗CML作用。SG511-BECN下调BCR/ABL具有特异性，与其携带的基因beclin-1密切相关，且BCR/ABL和beclin-1蛋白在胞内具有共定位现象，表明beclin-1和BCR/ABL蛋白在胞内存在直接作用。电镜下SG511-BECN处理组较SG511处理组在胞浆及胞核内观察到更多的病毒聚集，目前研究表明，自噬溶酶体途径和内吞外泌体途径相互作用密切相关，在增强自噬的情况下，感染腺病毒的细胞更易崩解，腺病毒更容易在胞内扩增并释放。那么SG511-BECN诱导的自噬是否会影响内吞外泌体途径，进一步导致溶瘤腺病毒在细胞内进一步扩增？以及该过程伴随的免疫变化在抗肿瘤中作用如何？目前已完善相关文献的学习并完成英文综述（详见附录综述），拟进一步深入研究。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

绪论

第一部分 新型小分子药物JNJ-165抑制T315I突变BCR/ABL的机制及其临床应用价值研究

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料、仪器和试剂

1．2 实验方法

2 结果

2．1 JNJ-165通过caspase非依赖途径发挥抗CML作用

2．2 JNJ-165对CML细胞株及原代细胞BCR/ABL的影响

2．3 从启动子及转录水平研究JNJ-165下调BCR/ABL的作用机制

2．4 从蛋白质水平研究JNJ-165下调BCR/ABL的作用机制

2．5 JNJ-165协同第一代TKIs对CML的细胞毒作用

2．6 动物实验

2．7 毒理实验：JNJ-165对正常骨髓干细胞的毒副作用

3 讨论

4 小结

第二部分 新型溶瘤腺病毒SG511-BECN对多重耐药CMLBCR/ABL的抑制作用及机制研究

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料、仪器和试剂

1．2 实验方法

2 结果

2．2 SG511-BECN通过非凋亡途径抑制多重耐药细胞K562-A02

2．3 SG511-BECN靶向自噬通路而发挥抗CML作用

2．4 SG511-BECN诱导自噬的发生和ROS表达的关系研究

2．5 SG511-BECN协同Dox抗CML作用

2．6 SG511-BECN和Dox作用于CML细胞自噬和凋亡相关蛋白检测

2．7 Dox增强SG511-EGFP在CML细胞中的感染率

2．8 SG511和Dox在CML细胞中的联合作用

2．9 SG511-BECN对BCR/ABL及下游信号通路的作用

2．10 Beclin-1和BCR/ABL蛋白在胞内共定位现象

2．11 SG511-BECN诱导的自噬促进腺病毒扩增?

3 讨论

4 小结

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果