高亲和力ABLSH3片段竞争性结合RIN1抑制BCR-ABL活性和增加伊马替尼敏感性的研究

摘要

Bcr-Abl融合蛋白具有异常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）的典型标志，位于Abl段的SH3结构与Bcr-Abl蛋白激酶活性激活有着直接的关系，可负向调控Bcr-Abl的活性，其关键位点的突变或结合配体的改变均可引起伊马替尼（Imatinib，IM）耐药。有研究发现耐 IM慢粒细胞株 KCL22高表达RIN1蛋白，而对IM敏感的细胞株中RIN1表达较低。RIN1是作为Abl的一个直接的激活因子控制对IM敏感的调定点。RIN1是Ras抑制因子1，含Abl结合结构域（Abl binding domain，ABD）。RIN1富含脯氨酸的序列（PPAVPPPPVP）通过与Abl的SH3（PxxP motif）低亲和力的结合引起 RIN1 Tyr36的磷酸化，随后和 SH2作用，导致Abl构象的改变，自抑制结构被解除，激活Bcr-Abl，继而促进Abl底物的磷酸化，而对Bcr-Abl蛋白的表达无影响，并且这种作用不依赖于SRC介导的Abl酪氨酸激酶结构域（TKD）磷酸化活性，亦不受Bcr-Abl T315I突变的影响。因此，RIN1已经成为IM耐药的研究热点之一。
　　本课题尝试采用直接阻滞Bcr-Abl与RIN1两者之间作用的策略，通过计算机模拟技术，筛选Abl SH3与RIN1 ABD结合的最佳片段，并在保持其高度特异性的前提下，将Abl SH3结构突变，使RIN1与Bcr-Abl SH3结构的低亲和力结合方式转变为高亲和力。通过构建突变体重组腺病毒载体，分别选取高表达和低表达 RIN1的细胞株 KCL22（耐IM细胞株）和K562及IM耐药的K562/G01为模型，研究其在细胞内是否通过竞争性结合的方式与RIN1相结合从而调控Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，同时联合 IM用药，在体外细胞实验探讨高亲和力的Abl SH3对CML细胞株的影响及相关的作用机制。旨在为CML联合用药和耐药治疗奠定基础。
　　采用的主要实验方法如下：
　　1.利用分子动态模拟和计算机分子模拟软件找出Abl SH3片段与RIN1富含脯氨酸区域结合的关键氨基酸，结合文献报道，突变单/两个氨基酸位点或改变序列长度，NAMD2.8软件Amber力场下动力学模拟突变后的结构，PepSite2.0软件预测SH3突变体与RIN1富含脯氨酸膜体的结合，根据P值大小判断亲和力。VMD1.8.7和PyMCL可视化图形软件分析不同的SH3突变体结构，计算RMSd分析结构的稳定性。设置对照：反义突变（结合力下降）和野生型（未突变）。
　　2.构建重组腺病毒载体表达 SH3-m突变体（SH3-mutant）和野生型，通过实验验证突变体的作用，继而筛选有效应的高亲和力突变体。免疫荧光法检测突变体和野生型在 CML细胞中的定位；Western blot测定突变体的有效性。免疫共沉淀和质谱技术分析SH3-m与RIN1的相互作用。选择作用效果明显的突变体进行后续的实验。
　　3.体外细胞实验分析上述筛选出的SH3-m突变体联合IM用药，对KCL22和 K562细胞的效应及 Bcr-Abl活性的影响和作用机制。MTT和流式细胞术检测细胞周期分析细胞增殖情况；光镜检测细胞结构变化、流式细胞术分析突变体对细胞凋亡的影响；Western blot分析Bcr-Abl活性、底物磷酸化水平的变化以及 Bcr-Abl下游 PI3k/Akt、Ras/Raf/Mek/Erk1/2信号通路各指标的变化；免疫荧光技术观察细胞骨架的重建情况。
　　获得的实验结果和结论如下：
　　1.用计算机分子模拟技术（PepSite2.0软件）分析出RIN1富含脯氨酸的结构域与 Abl SH3结构域结合的关键氨基酸是位于 Abl SH3 domain上疏水口袋周围的含有苯环或类苯环的芳香族氨基酸（脯氨酸：Pro、色氨酸：Trp、天冬氨酰：Asn、酪氨酸：Tyr、苯丙氨酸：Phe），将这些氨基酸进行一系列突变，P-value预算结合特异性，选择结合能力高的三个突变体T79Y，N94W和T79YN94W（双突变）和结合能力低的突变体：W99R及野生型结构，NAMD和VMD软件成功演算稳定的结构。其中，低结合能力W99R及野生型为对照。
　　2.成功构建六个重组腺病毒载体（包括不含目的片段的载体）：pAd-SH3、pAd-W99R、pAd-N94W、pAd-T79Y、pAd-T79YN94W和pAd-null（以下分别简称为：M0、M1、M2、M3、M4、T）。各种突变体能高效感染靶细胞并有不同的亚细胞定位：M0、M1、M3和T位于胞浆，M2和M4定位于胞浆和胞核。Western blot结果表明：与M0和T相比较，M1和M3抑制Bcr-Abl磷酸化蛋白的表达，抑制下游Stat5和Crkl磷酸化水平，而M2和M4作用与此相反。免疫共沉淀和质谱检测均证实M3、M4能与RIN1结合，M1不能与RIN1结合。因此，后续实验重点研究高亲和力M3的效应及机制。
　　3.体外细胞实验证明，高亲和力 M3突变体联合 IM能显著抑制KCL22和K562细胞生长，使细胞周期阻滞在S期，在IM中等耐药细胞株KCL22中效果优于IM敏感株K562。形态学观察到两株细胞均出现核碎裂、空泡和核聚集的现象，流式细胞术检测发现细胞凋亡；Western blot显示能明显抑制Bcr-Abl、Stat5和Crkl磷酸化水平，以及下调凋亡相关蛋白 Bcl-2、c-Myc和周期蛋白 CyclinD1的表达，上调Bax的表达。免疫荧光观察到细胞骨架微丝或者微管蛋白出现明显的聚集，且有边缘化或者向中间聚集的现象。实验中意外发现：M1突变体虽未与RIN1结合，但联合IM也能显著抑制KCL22和K562细胞增殖，促进细胞凋亡。
　　综上所述，本课题将计算机模拟技术筛选出的高亲和力 Abl SH3突变体M3联合IM用药，体外实验显示能有效地抑制CML细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制是阻滞了Bcr-Abl与RIN1的结合，从而抑制了Bcr-Abl活性及底物和磷酸化。本文的意义在于，通过对Abl SH3结构及其与Bcr-Abl活性关系的深入研究，为CML治疗方面特别是IM耐药患者提供了分子靶点，同时也为临床联合用药奠定了前期基础。另外，研究中发现的M1的作用效果还给课题组留下了深入研究的线索。

目录

符号说明

前言

参考文献

第一部分 计算机模拟筛选Abl SH3与RIN1 ABD 结合的最佳片段

1 材料与方法

2 结果

3讨论

小结

第二部分 Abl SH3突变体重组腺病毒载体构建、鉴定及生物学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

第三部分 高亲和力Abl SH3片段M3联合IM对CML细胞效应及作用机制的研究

1 材料与方法

2 结果

3讨论

小结

参考文献

全文总结

课题创新之处

不足之处及后续研究计划

文献综述:Rin1在慢性粒细胞白血病治疗中的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的文章