三七总皂苷联合硫酸黏菌素抗大肠杆菌感染作用的研究

摘要

大肠杆菌感染在兽医临床上十分常见。大肠杆菌侵入动物体后，细菌裂解释放出细胞壁成分脂多糖(Lipolysaccharides，LPS)。LPS通过血液循环进入全身，结合并活化细胞膜上的TLR4受体，使细胞过量表达炎症因子（如IL-1、IL-4、TNF-α、IFN-γ），损害器官组织，使动物发热，引起全身性炎症反应，导致败血症或败血性休克，甚至引起死亡，因此，LPS又称细菌内毒素(Endotoxin)。前期研究表明，人参皂苷Rg1可以和LPS竞争性结合到TLR4受体上，缓解由LPS引起的炎症反应。多黏菌素E(Polymyxin E，PME)除了具有抗菌作用外还能结合游离的LPS使其失活，是兽医临床上治疗革兰氏阴性菌感染的常用药。但正常治疗剂量的PME对机体有毒性作用，如恶心、呕吐、过敏性皮炎、蛋白尿、神经肌肉阻滞、瘫痪等症状，而在亚临床治疗剂量下PME对机体却无毒性作用。本文研究人参皂苷Rg1联合亚临床剂量的PME对LPS染毒和大肠杆菌感染动物的治疗作用，为临床上用PME治疗大肠杆菌感染减少毒副作用提供参考。研究内容包括以下四部分:
　　第一部分，为观察人参皂苷Rg1与PME配伍使用是否能产生更好的抗LPS的效果，将70只小鼠随机分为7组，每组10只。组1～6小鼠腹腔注射LPS(0.5mg/只)，15min后组1～3皮下注射PME（60μg/只）与Rg1(0.125，0.25，0.5mg/只)的混合溶液，组4和组5分别注射Rg1(0.5mg/只)和PME（60μg/只），注射3次，间隔30min。组6为LPS染毒不注射PME和Rg1的对照组，组7为生理盐水注射组。观察并记录小鼠染毒后72h内的死亡情况。结果显示:组1～6小鼠死亡率分别为100％、100％、80％、50％、30％和80％，生理盐水注射组无死亡。由此可见，单独注射Rg1或PME可使小鼠死亡率降低，Rg1和PME混合后注射反而使小鼠死亡率升高，表明Rg1和PME混合注射不能降低LPS染毒小鼠的死亡率。
　　第二部分，为观察人参皂苷Rg1与PME不同部位注射对大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)感染的治疗效果，将40只小鼠随机分为4组，每组10只。组1～3小鼠腹腔注射6×107CFU/只的大肠杆菌建立小鼠大肠杆菌感染模型，感染后4h，组2和组3分别肌肉注射PME(30μg/只)，注射2次，间隔1h;感染后8h组3皮下注射Rg1(0.5mg/只，100μL)，注射3次，间隔30min。组1为大肠杆菌感染对照组，组4为生理盐水注射组。观察并记录小鼠染毒后72h内的死亡情况。结果显示:组1～3小鼠死亡率分别为100％、40％和80％，生理盐水注射组无死亡。由此可见，单独注射PME小鼠死亡率降低，Rg1和PME联合用药小鼠死亡率升高。
　　第三部分，为观察以人参皂苷Rg1为主要成分的三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)与PME配伍对大肠杆菌感染小鼠的防治作用，将70只小鼠随机分为7组，每组10只。组3和组4小鼠连续7天灌胃三七总皂苷溶液1.0mg/只/天;于结束灌胃次日，组1～6小鼠分别腹腔注射大肠杆菌6×107CFU/只，感染E.coli后4h，组2、组4和组6小鼠分别肌肉注射PME(30μg/只)，注射2次，间隔1h;然后，组5和组6小鼠灌胃三七总皂苷溶液(1.0mg/只/天)，连续灌胃3天。组1为感染对照组，组7为生理盐水注射组。观察并记录小鼠感染大肠杆菌72h内死亡情况。结果显示:组1～6小鼠死亡率分别为90％、70％、80％、40％、100％、60％，生理盐水注射组无死亡。由此可见，PNS预防联合PME治疗可显著降低小鼠死亡率。
　　第四部分，为观察PNS与PME联合用药对家兔大肠杆菌感染的治疗作用，将15只新西兰大白兔(2.5±0.2kg)随机分成5组，每组3只。组3和组4兔子每天灌胃三七总皂苷溶液(10mg/kg)，连续7天;组1、组2和组5每天灌胃等量生理盐水。于结束灌胃次日，组1～4颈部皮下注射大肠杆菌(1×109CFU/kg)，组2和组4耳缘静脉注射PME(1mg/kg);组1、组3和组5以同样方法注射等量生理盐水。组1为感染对照组，组5为生理盐水注射组。感染前2天，每天测3次体温，以观察体温正常与否。感染后12h之内每隔1h测一次体温，感染后24h和48h各测一次体温;并于48h采集抗凝血1ml，检测血常规和血生化指标。结果表明:组5（生理盐水注射组）家兔体温试验期间无显著变化，血常规和血生化指标处于正常生理范围内。组1（感染组）家兔感染大肠杆菌后，体温急剧升高，并呈现双峰热，感染后2h和9h出现体温高峰，体温从39.5℃升高至40.8℃，感染后48h体温仍在40.6℃;感染后48h，组1血常规指标（包括红细胞总数、红细胞压积、血红蛋白、平均血红蛋白含量、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞均显著降低，而白细胞、中性粒细胞、血小板总数和血小板分布宽度）和血生化指标（包括镁和白蛋白含量显著降低，而尿素氮、肌酐、磷、球蛋白、谷草转氨酶、肌酸激酶和磷酸脱氢酶）均显著升高。在各药物治疗组，感染后11h，组2(PME)家兔体温从40.4℃升高至41.0℃，其它时间点与组1体温无显著差异;感染后48h，红细胞总数显著升高，血糖含量和谷草转氨酶显著降低。与组1相比，以感染后8h为起点，组3(PNS)家兔体温从40.5℃降至39.9℃，8h～12h该组家兔体温持续显著低于组1，但12h～48h未表现出显著缓解体温升高的作用;感染后48h，组3对血液生理和生化指标无显著作用。相比于组1，组4(PNS+PME)感染后6h体温开始显著下降，从40.1℃降至39.7℃，48h降至39.2℃;感染后48h，联合用药组血常规指标中平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度和嗜碱性粒细胞显著升高，白细胞、中性粒细胞和血小板分布宽度显著降低;血生化指标中尿素氮、肌酐、磷、谷草转氨酶、肌酸激酶和乳酸脱氢酶显著降低，镁和白蛋白含量显著降低。由此可见，联合用药在感染后6h～48h可显著缓解体温升高，48h时可明显缓解感染所致的血常规和血液生化指标的变化。
　　综上所述，本研究的结果表明Rg1和PME混合注射不能降低LPS染毒小鼠的死亡率，两者在不同部位注射亦不能降低大肠杆菌感染小鼠的死亡率;但含Rg1的三七总皂苷预防结合PME治疗可显著降低大肠杆菌感染小鼠引起的死亡率，并可缓解E.coli感染家兔引起的体温升高，改善感染家兔的血常规和血液生化指标的变化。因此，三七总皂苷与低剂量PME联合用药用于治疗动物的大肠杆菌感染值得进一步研究。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述

第一节 细菌内毒素的研究进展

1．细菌内毒素的来源和结构特点

2．细菌内毒素的生物学活性

3．细菌内毒素的致病机理

4．抗内毒素药物的研究现状

第二节 硫酸黏菌素的研究进展

1．硫酸黏菌素的药理和毒理学

2．硫酸黏菌素的代谢动力学

3．硫酸黏菌素在动物体内残留研究

第三节 三七总皂苷与人参皂苷Rg1

1．三七总皂苷及其化学组成

2．三七总皂苷的药理作用

3．人参皂苷R91的药理作用

技术路线

第二章 Rg1和PME对LPs染毒小鼠的治疗作用研究

实验一 LPs诱导小鼠死亡的染毒剂量研究

1．材料和方法

2．结果与分析

实验二 Rg1和PME分别治疗LPS染毒小鼠的研究

1．材料和方法

2．结果与分析

实验三 Rg1和PME配伍治疗LPS染毒小鼠的研究

1．材料和方法

2．结果与分析

本章小结

第三章 Rg1和PME对大肠杆菌感染小鼠的治疗作用研究

实验一 大肠杆菌致死小鼠的感染剂量研究

1．材料和方法

2．结果与分析

实验二 不同剂量PME对大肠杆菌感染小鼠的治疗作用

1．材料和方法

2．结果与分析

实验三 大肠杆菌感染小鼠后血浆中LPS浓度的检测

1．材料和方法

2．结果与分析

实验四 Rg1和PME不同部位注射联用对大肠杆菌感染小鼠的治疗作用

1．材料和方法

2．结果与分析

本章小结

第四章 三七总皂苷联合PME对大肠杆菌感染小鼠的防治作用

实验一 三七总皂苷与人参茎叶皂苷预防小鼠大肠杆菌感染的研究

1．材料和方法

2．结果与分析

实验二 三七总皂苷与PME配伍对小鼠大肠杆菌感染的治疗作用

1．材料和方法

2．结果与分析

本章小结

第五章 三七总皂苷联合PME对大肠杆菌感染家兔的治疗作用

1．材料和方法

2．结果与分析

本章小结

第六章 综合讨论

结论

创新点

研究展望

参考文献

致谢