喉癌、下咽癌患者血清exosomes的提取分离鉴定及在诊断中应用价值的初步研究

摘要

目的：
　　提取并检测喉癌、下咽癌的exosomes并探讨其临床意义。
　　方法：
　　收集我院2015年2017年22例头颈部癌患者术前外周血，其中喉癌11例，下咽癌11例，并收集11例正常人血液作为对照组，经我院科研伦理审查委员会批准，与患者及家属签署知情同意书，进行人体外周血液标本的以下研究。
　　1.通过采集喉癌、下咽癌患者和正常人的血液，用试剂盒System Biosciences(EXOTC10A-1)提取exosomes。
　　2.采用透射电子显微镜下观察exosome形态。
　　3.采用纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)对exosomes进行计数（即颗粒浓度）和测粒径。
　　4.采用法蛋白浓度定量试剂盒(Bicinchoninic acid，BCA)检测exosomes蛋白浓度。
　　5.采用蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测蛋白的表达。
　　6.检测exosomes在头颈部恶性肿瘤患者（喉癌、下咽癌）22例及正常人11例中的表达，其中喉癌为11例、下咽癌11例，所有患者均病理明确诊断，收集11例正常人血液。
　　7.统计学处理：采用SPSS19.0统计软件。
　　结果：
　　1.从喉癌下咽癌患者的上清液中分离出肿瘤来源的exosomes是可行的。透射电子显微镜下观察exosomes具有杯状结构的特征，它们的直径在30～100nm之间。
　　2.喉癌组、下咽癌组来源的exosomes体积较对照组来源的exosomes体积更大。
　　3.与对照组来源的exosomes比较，喉癌组、下咽癌组来源的exosomes蛋白浓度显著增加(p＜0.05)。通过对照组与恶性肿瘤组（喉癌组+下咽癌组）的蛋白浓度-ROC曲线分析，得出曲线下面积(AUC)=0.926±0.046，当exosome蛋白浓度为2.8842mg/ml时，Youden指数达到最大为0.864。确定2.8842mg/ml为诊断临界值，诊断的敏感度为86.4％，特异性为100％。因此外周血exosomes蛋白浓度可作为喉癌、下咽癌早期诊断的指标之一。
　　4.对照组、喉癌组和下咽癌组的exosomes中均检测到CD63、CD81蛋白，没有检测到Calnexin蛋白。
　　5.对照组、喉癌组和下咽癌组的exosomes中颗粒浓度无明显差异(p＞0.05)。与对照组比较，喉癌组exosomes粒径增加，但无显著差异(p＞0.05)，下咽癌组的exosomes粒径显著增加(p＜0.01)。对照组与喉癌组的粒径-ROC曲线分析得出AUC=0.661±0.118，Youden指数最大为0.181，诊断的敏感度为63.6％，特异性为54.5％，敏感度和特异性均不高。但做对照组与下咽癌组的粒径-ROC曲线，得出AUC=0.979±0.024，当粒径为162nm时，Youden指数达到最大为0.818，因此确定162nm为诊断临界值，诊断的敏感度为100％，特异性为81.8％，因此外周血exosomes粒径可作为下咽癌早期诊断的指标之一。
　　结论：
　　喉癌、下咽癌患者外周血清来源的exosomes是十分有潜力的肿瘤标志物，可能对喉癌、下咽癌的早期诊断带来帮助。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2．1 病例

2．2 实验目的、材料与方法

2．3 统计方法

3 结果

3．1 一般临床资料

3．2 透射电镜检测exosomes

3．3 BCA蛋白检测exosomes蛋白浓度

3．4 Western Blot检测exosomes中CD63、CD81、Calnexin蛋白表达

3．5 NTA检测exosomes颗粒浓度、粒经

4 讨论

5 结论

参考文献

微囊泡和微泡变化与头颈部癌的疗效关系

作者简历及在学期间所取得的科研成果