手性合成芳基邻二醇醛缩酶的基因挖掘和分子改造

摘要

手性芳基邻二醇是一类重要的多官能团化合物，常作为有机合成、制药和精细化工等领域的关键手性砌块之一。在现有的制备手段中，以醛缩酶为代表的生物催化不对称合成方法具有立体选择性好、反应条件温和且原子利用率高的天然优势，因此是手性芳基邻二醇不对称合成的优选途径。但多数醛缩酶的底物谱较窄，且对非天然底物的催化活力较低，难以满足工业化应用的需求。基于这一现状，本研究开展了包括基因挖掘和酶分子改造在内的一系列研究，旨在开发具有高催化效率和高立体选择性的生物催化剂，用于手性芳基邻二醇的不对称制备。
　　首先利用基因挖掘的策略，对美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中不同来源的醛缩酶基因进行克隆，并对重组蛋白的表达条件包括诱导温度、诱导时长以及分子伴侣的共表达等，进行了一系列的探索和优化，最终实现了大部分重组蛋白的可溶性表达，从而完成相应醛缩酶库（包含25个醛缩酶）的构建。在此基础上，选取一系列醛类和酮类分别作为羟醛缩合反应的受体和供体，对构建的醛缩酶库进行筛选，最终获得两株能够催化肉桂醛与羟基丙酮(Hydroxyacetone，HA)发生羟醛缩合反应的重组酶，即来源于E.coli K12的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)和D-果糖-6-磷酸醛缩酶B(FSAB)。
　　在完成FSAA和FSAB表达条件的深度优化，实现二者的高效可溶性表达后，对二者进行酶学性质表征。相关结果显示，FSAA和FSAB的最适反应温度分别为30℃和25℃，且FSAA能在较宽的温度范围内(20～60℃)发生作用，热稳定性明显优于FSAB。鉴于热稳定性是影响生物催化剂工业化应用前景的重要因素之一，可以预见FSAA的工业化应用价值将大于FSAB，因此后续研究主要针对FSAA进行展开。此外，在保证自发反应转化率低于1％的前提下，FSAA在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mM，pH6.5)中具备最佳催化效率;为提高肉桂醛溶解度而添加的助溶剂均会导致该酶催化效率的降低，因此后期反应均不考虑添加任何助溶剂。
　　为了优化FSAA对肉桂醛的催化活力，尝试对该酶进行理性设计。首先采取减小空间位阻和引入分子间相互作用力的方式，对与底物间有直接相互作用的关键位点进行突变，但筛选结果显示所构建的突变体催化活力均未得到提高，表明上述策略并不适用于FSAA对肉桂醛催化性能的优化。随后对FSAA催化机理的分析显示，在其催化过程中涉及到一个参与质子传递的关键水分子，尝试将与该水分子形成氢键作用的三个位点(Q59，T109和Y131)突变为性质及结构相似的氨基酸残基，得到四个单点突变体(Q59N，Q59E，T109S和Y131F)。其中，突变体Q59N的活力达到了野生型的3倍。对59位点进行进一步突变，得到了活力分别达到野生型的23和25倍的两个突变体Q59T和Q59L。相关分子动力学模拟结果显示，十聚体FSAA的每个亚基C-末端的最后一个α-螺旋(α-helix)均绕至临近单体活性中心上方并与之产生界面相互作用，而59位点的改变会对该α-螺旋的走向产生一定的影响，进而影响FSAA催化肉桂醛的活力:此外，59位点虽然不与底物直接接触，但能通过氨基酸残基相互作用网(Residueinteraction network)对FSAA的活力产生间接影响。以上结果表明，在选择突变位点进行酶分子活力优化时，除了考虑与底物具有直接相互作用的位点，对活性中心附近处于氨基酸残基相互作用网中的位点进行改造也能起到很好的效果。
　　考虑到FSAA是一个多亚基酶，且每个亚基C-末端的最后一个α-螺旋(α-helix)与临近单体的活性中心间形成界面相互作用，本论文提出通过协同调控亚基内和亚基间相互作用的方式来优化FSAA对噻吩类杂环芳香醛的催化性能。经过一系列的突变筛选，最终获得了一个组合突变体FSAAI31T/Q59T/I195Q，通过改造31位点实现对亚基内相互作用的调控，而对59位点和195位点的替换则用于调控亚基间相互作用，其对噻吩-2-甲醛、噻吩-3-甲醛、苯并噻吩-2-甲醛、糠醛和吡啶-2-甲醛的催化效率达到了野生型的27-278倍。利用此突变体作为全细胞催化剂能在较高底物浓度(350-500mM)下催化上述芳香醛与HA发生羟醛缩合反应，实现了目标手性芳基邻二醇的高效制备，相应的转化率达到70％-95％，具有广阔的应用前景。组合突变体催化效果的显著提升证实了本论文所采用的协同调控策略的有效性，可为具有类似多亚基结构酶制剂的催化性能改造提供有益的借鉴。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 手性化合物简介

1．2 手性邻二醇

1．2．1 手性邻二醇简介

1．2．2 手性芳基邻二醇简介

1．2．3 手性芳基邻二醇的合成

1．3 不对称羟醛缩合反应

1．3．1 不对称羟醛缩合反应简介

1．3．2 酶促不对称羟醛缩合反应

1．4 醛缩酶

1．4．1 醛缩酶简介

1．4．2 醛缩酶催化机理与分类

1．4．3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A

1．5 酶分子改造

1．5．1 定向进化

1．5．2 半理性设计

1．5．3 理性设计

1．6 分子模拟

1．6．1 量子力学模拟

1．6．2 分子力学模拟

1．6．3 分子动力学模拟

1．6．4 分子对接

1．6 本课题研究的意义及内容

2 醛缩酶库的构建和筛选

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 工具酶及试剂

2．2．3 实验所需培养基

2．2．4 培养条件

2．2．5 主要仪器

2．2．6 基因组的提取

2．2．7 醛缩酶基因的扩增及重组质粒的构建

2．2．8 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备及转化

2．2．9 重组子的鉴定与表达

2．2．10 醛缩酶基因的诱导表达条件探索

2．2．11 分析方法

2．2．12 醛缩酶催化活力筛选

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 目的基因的扩增和克隆

2．3．2 目标蛋白的可溶性表达

2．3．3 醛缩酶催化活力筛选

2．4 本章小结

3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A／B(FSAA／FSAB)的酶学性质表征及相关产物的鉴定

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料与试剂

3．2．2 主要仪器

3．2．3 重组蛋白的诱导及表达

3．2．4 分析方法

3．2．5 肉桂醛和羟基丙酮(HA)间羟醛缩合反应消旋产物的制备

3．2．6 自发反应的检测

3．2．7 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A／B(FSAA／FSAB)表达条件再优化

3．2．8 重组蛋白的纯化

3．2．9 催化性质表征

3．2．10 FSAA全细胞催化肉桂醛与HA间羟醛缩合反应

3．2．11 酶促产物的环化

3．2．12 电子圆二色谱(Electrollic circular dichroism simulation，ECD)模拟

3．2．13 催化活力检测

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 合成产物的表征

3．3．2 肉桂醛与羟基丙酮(HA)间自发羟醛缩合反应

3．3．3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A／B(FSAA／FSAB)的表达与纯化

3．3．4 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A／B(FSAA／FSAB)催化条件优化

3．3．5 酶促产物绝对构型确认

3．3．6 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A不对称催化肉桂醛与HA间羟醛缩合反应

3．4 本章小结

4 理性设计FSAA以提高其对肉桂醛类似物和HA的催化活力

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料与试剂

4．2．2 主要仪器

4．2．3 重组细胞的培养、诱导及表达

4．2．4 FSAA催化的羟醛缩合反应

4．2．5 合成产物的表征

4．2．6 分子对接

4．2．7 突变体的构建

4．2．8 阳性克隆培养、目标蛋白表达与纯化

4．2．9 FSAA酶活测定

4．2．10 针对天然底物的酶活测定

4．2．11 表观动力学参数的测定

4．2．12 分析方法

4．2．13 蛋白-配体复合物构建

4．2．14 分子动力学模拟

4．2．15 分子动力学模拟结果分析

4．2．16 重组大肠杆菌全细胞催化羟醛缩合反应

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 合成产物的结构鉴定

4．3．2 突变位点的确定及突变体的构建

4．3．3 FSAA野生型及突变体活力初筛

4．3．4 FSAA野生型及突变体活力复筛

4．3．5 FSAA野生型及部分突变体催化天然底物的活力分析

4．3．6 表观动力学参数分析

4．3．7 FSAA的分子模拟及能量计算

4．3．8 全细胞催化

4．4 本章小结

5 协同调控FSAA亚基内及亚基间相互作用以提高其对杂环芳香醛的催化活力

5．1 引言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 实验材料与试剂

5．2．2 主要仪器

5．2．3 重组细胞的培养、诱导及表达

5．2．4 噻吩类杂环醛与羟基丙酮间羟醛缩合产物3a-3e的制备

5．2．5 突变体构建

5．2．6 阳性克隆培养、目标蛋白表达和纯化

5．2．7 酶活测定

5．2．8 表观动力学常数的测定

5．2．9 分析方法

5．2．10 蛋白-配体复合物构建

5．2．11 分子动力学模拟

5．2．12 重组大肠杆菌全细胞催化杂环芳香醛与HA间羟醛缩合反应

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 合成产物的分离鉴定

5．3．2 突变位点的确定与构建

5．3．3 突变体活力测定及组合突变体的构建

5．3．4 分子动力学模拟及动力学常数分析

5．3．5 立体选择性分析

5．3．6 全细胞催化

5．4 本章小结

6 结论与展望

参考文献

附录

作者简介