卤醇脱卤酶的基因挖掘、催化性能及其分子改造研究

摘要

卤醇脱卤酶能够在温和条件下催化邻卤醇脱卤和环氧化物的开环，在手性环氧化物和β-取代醇的合成方面具有极大的应用潜力。但是到目前为止立体选择性优异的卤醇脱卤酶仅有HheC，为了满足应用的需求，开发新型高效、选择性好、活性高的生物催化剂，已经成为卤醇脱卤酶工业应用基础研究的重点研究方向。 本文首先以HheC和HheB为基因探针，通过基因挖掘法获得了10种潜在的卤醇脱卤酶基因，其中9种在大肠杆菌中成功表达。以苯基缩水甘油醚（(R,S)-PGE）为模式底物，通过显色反应和高效液相色谱检测比较，筛选获得3种高活性且具有不同选择性的卤醇脱卤酶；经引入组氨酸标签后，确定了一种来源于菌株Pseudomonas pohangensis的HHDHHis10作为后续研究对象，其与HheB的同源性为44%，与HheC的同源性为31%，并对(R,S)-PGE表现出R选择性。 通过Ni-NTA柱纯化目标蛋白，并对其酶学性质进行研究。其最适脱卤反应温度为40℃，最适脱卤反应pH为10.0，最适开环反应pH为7.5，该酶在pH6.0-7.5范围内和温度低于50℃时具有较好的稳定性。HHDHHis10具有较广的底物谱，对多种卤代醇和环氧化物表现出较好的活性及对映选择性。该酶对底物(R,S)-PGE的Km为31.75mM，Vmax为32.79μmol·min-1·mg-1。HHDHHis10对(R,S)-PGE表现出较好的对映选择性，在20mM的底物浓度下，获得的(S)-PGE的ee值和收率分别为>99%和16.35%；在pH7.5和pH8.0条件下，HHDHHis10催化拆分1-氯-3-苯氧基-2-丙醇(7)的单酶串联反应中，获得的(R)-7的ee值均可达>99%，收率约为25%。 为提高酶的立体选择性，尝试对酶进行半理性设计改造，利用同源建模和分子对接技术，选定底物结合口袋附近的6个氨基酸残基（Gln159、Asn160、Phe161、Tyr167、Phe168和Pro169）进行定点饱和突变和组合突变。以(R,S)-PGE为模式底物，通过高效液相色谱检测，获得3个立体选择性提高的突变体，分别是Q159L、N160L和P169Q，其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80,21.10和10.84，其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的。还尝试对突变体进行叠加突变，但是并未检测到选择性提高的阳性突变体。利用亲和层析分离纯化突变体N160L和Q159L，结果发现突变后的酶活相比较于原始HHDHHis10明显降低，分别为原始酶的56.75%和47.45%。通过对突变体N160L与Q159L的环氧化物底物谱进行研究，两突变体除了对底物邻乙基苯基缩水甘油醚(12)和苯基环氧乙烷(16)选择性没有提高以外，对于其它底物的选择性均有一定程度的提高，尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚(11)的E值提高到了25.77，是原始HHDHHis10的13.93倍。 对突变体N160L与原始HHDHHis10对映选择性相反的机理进行分析，结果表明：通过将突变体N160L与(R)-PGE和(S)-PGE分子对接发现，两个氨基酸残基Ser116和Tyr129与(R)-PGE和(S)-PGE底物的氧原子之间形成的氢键的距离不同，导致发生作用的作用力存在差异，从而出现了构型逆转的现象。利用突变体N160L动力学拆分(R,S)-PGE(20-200mM)，获得(R)-PGE的最大ee值可达>99%，收率最高达到30.92%。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 卤醇脱卤酶

1.2 卤醇脱卤酶的催化机理

1.3 卤醇脱卤酶的基因挖掘

1.4 卤醇脱卤酶的应用

1.4.1卤醇脱卤酶在卤代醇脱卤反应中的应用

1.4.2 卤醇脱卤酶在环氧化物拆分中的应用

1.4.3 卤醇脱卤酶在单酶串联反应中的应用

1.4.4 卤醇脱卤酶在与其他酶的偶联反应中的应用

1.5 卤醇脱卤酶的分子改造研究

1.5.1 卤醇脱卤酶的定向进化

1.5.2 卤醇脱卤酶的理性或半理性设计

1.6 本论文的研究目的及意义

1.7 本论文的主要研究内容

第2章 卤醇脱卤酶的基因挖掘

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 主要设备与仪器

2.2.2菌株及质粒

2.2.3 酶与试剂

2.3 实验方法

2.3.1 培养基及常用试剂的配制

2.3.2 卤醇脱卤酶的基因挖掘

2.3.3 卤醇脱卤酶表达载体的构建

2.3.4 卤醇脱卤酶的诱导表达

2.3.5 卤醇脱卤酶的序列分析

2.3.6 卤醇脱卤酶的高通量筛选

2.3.7 卤醇脱卤酶酶活测定

2.3.8 分析方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 卤醇脱卤酶的基因挖掘

2.4.3 卤醇脱卤酶的诱导表达

2.4.4 重组卤醇脱卤酶的功能筛选

2.5 本章小结

第3章 卤醇脱卤酶的酶学性质研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 主要实验试剂

3.2.3 菌株与质粒

3.2.4 相关溶液的配制

3.3 实验方法

3.3.1 卤醇脱卤酶的纯化

3.3.2 卤醇脱卤酶最适温度及温度稳定性

3.3.3 卤醇脱卤酶最适pH及pH稳定性

3.3.4 卤醇脱卤酶底物特异性

3.3.5 卤醇脱卤酶动力学参数

3.3.6 卤醇脱卤酶酶活测定

3.3.7 分析方法

3.3.8 卤醇脱卤酶催化拆分Rac-PGE合成手性纯的PGE

3.3.9 卤醇脱卤酶单酶串联催化合成手性纯的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇

3.4 结果与讨论

3.4.1 卤醇脱卤酶的分离纯化

3.4.2 温度对卤醇脱卤酶HHDHHis10的酶活及稳定性的影响

3.4.3 pH对卤醇脱卤酶的酶活及稳定性的影响

3.4.4 卤醇脱卤酶的底物特异性

3.4.5 卤醇脱卤酶动力学参数的测定

3.4.6 卤醇脱卤酶催化Rac-PGE合成手性纯的PGE

3.4.7 卤醇脱卤酶催化合成对映体纯的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇

3.5 本章小结

第4章 卤醇脱卤酶分子改造的初步探索

4.1 引言

4.2材料

4.2.1 菌株与质粒

4.2.2 酶与试剂

4.2.3 主要仪器

4.2.4 引物

4.3 实验方法

4.3.1 同源建模

4.3.2 分子对接

4.3.3 感受态细胞的制备

4.3.4 饱和突变文库的构建

4.3.5 高通量筛选模型的建立与突变文库的筛选

4.3.6 卤醇脱卤酶HHDHHis10及其突变体的表达与分离纯化

4.3.7 卤醇脱卤酶酶活测定

4.3.8 卤醇脱卤酶及其突变体动力学参数的测定

4.3.9分析方法

4.3.10 突变体催化拆分Rac-PGE合成手性纯的PGE

4.4 结果与讨论

4.4.1 卤醇脱卤酶同源建模

4.4.2 分子对接与突变位点的选择

4.4.3 突变文库的构建及筛选

4.4.4 卤醇脱卤酶及其突变体的分离纯化

4.4.5 卤醇脱卤酶及其突变体的底物特异性

4.4.6 动力学常数的测定

4.4.7 机理分析

4.4.8 突变体N160L催化拆分(R,S)-PGE

4.5 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢