基于膜结合l-氨基酸脱氨酶重组表达菌株的α-酮酸及其衍生物制备研究

摘要

α-酮酸具有二羰基结构，是多种生理活性物质的合成中间体，在食品、医药及化工行业应用广泛。生物酶法催化氨基酸制备α-酮酸及其衍生物具有高效、环保和成本低的特点。在催化氨基酸产生α-酮酸的酶类中，膜结合L-氨基酸脱氨酶(mL-AAD)不需要辅酶或氨基受体，不会产生对α-酮酸具有氧化破坏作用的过氧化氢，是制备α-酮酸及其衍生物的较为理想用酶。本文以普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的mL-AAD为研究对象，优化了分泌表达策略和条件。在此基础上，利用表达mL-AAD的重组工程菌进行了苯丙酮酸(PPA)、3,4-二羟基苯丙酮酸(DHPPA)及相应衍生物苯乳酸(PLA)、丹参素(SAA)的生物制备过程研究。主要结果有:
　　1.在pET-28a、pET-20b两个质粒中，分别利用mL-AAD自带的tat信号肽（双精氨酸分泌途径）和pelB（保守分泌途径）-tat整合信号肽介导mL-AAD分泌表达，发现采用自身tat信号肽介导mL-AAD分泌的表达方式(BL21(DE3)-pET-28a-mlaad)可以获得更优的菌体生长性能和脱氨活力。
　　2.以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物，利用工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备PPA。在优化条件下（pH=8.0，温度37℃，菌体浓度:0.39g/L，L-Phe浓度:150mmol/L），反应42h可得到141mmol/L PPA。在此基础上，利用共表达D-2-羟基异己酸脱氢酶（来自Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus）和甲酸脱氢酶（来自Mycobacterium vaccae N10）的工程菌将制备的PPA转化为PLA，在优化条件下，可得到121mmol/L PLA，综合转化率达到80.7％。
　　3.以L-多巴(L-Dopa)为底物，利用工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备DHPPA。在优化条件下（pH=8.5，温度37℃，菌体密度:0.37g/L，L-Dopa浓度:100mmol/L），反应1h可得到28.5mmol/L DHPPA。在此基础上，利用共表达D型乳酸脱氢酶（来自Pediococcus acidilactici DSM20284）和甲酸脱氢酶（来自M.vaccae N10）的工程菌将制各的DHPPA转化为SAA，在优化条件下，可得到11.66mmol/L SAA。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1．1 芳香族α-酮酸及其衍生物

1．1．2 α-酮酸的合成方法

1．2 膜结合L-氨基酸脱氨酶概述

1．2．1 膜结合L-氨基酸脱氨酶的异源表达

1．2．2 膜结合L-氨基酸脱氨酶的晶体结构

1．3 研究目的和主要研究内容

第二章 膜结合L-氨基酸脱氨酶工程菌的构建

2．1 引言

2．2 主要实验设备和材料

2．2．1 质粒和菌种

2．2．2 酶及分子生物学试剂

2．2．3 化学试剂

2．2．4 溶液配制

2．2．5 主要实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 mlaad基因获取与质粒构建流程

2．3．2 重组质粒的构建

2．3．3 重组大肠杆菌的诱导表达

2．3．5 分析测定方法

2．3．6 不同表达策略的比较

2．3．10 mL-AAD工程菌底物谱分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 重组质粒pET-20b-mlaad和pET-28a-mlaad的构建

2．4．2 不同表达策略对菌体表观催化活力的影响

2．4．3 过表达mL-AAD对宿主细胞的影响

2．4．4 诱导剂浓度的优化

2．4．5 mL-AAD工程菌底物谱分析

2．5 本章小结

第三章 膜结合L-氨基酸脱氨酶工程菌制备苯丙酮酸及苯乳酸的研究

3．1 引言

3．2 主要实验设备和药品

3．2．1 主要实验设备

3．2．2 主要实验药品

3．3 实验方法

3．3．1 BL21(DE3)-pETDuet-dhd-fdh重组菌株的构建

3．3．3 分析测定方法

3．3．4 BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备PPA反应条件优化

3．3．5 PPA的制备

3．4．1 BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备PPA反应条件优化

3．4．2 PPA的制备

3．4．3 BL21(DE3)-pETDuet-dhd-fdh重组菌株的构建

3．4．4 BL21(DE3)-pETDuet-dhd-fdh制备PLA反应条件优化

3．4．5 PLA的制备

3．5 本章小结

第四章 膜结合L-氨基酸脱氨酶工程菌制备3，4-二羟基苯丙酮酸及丹参素的研究

4．1 引言

4．2 实验设备和药品

4．2．1 主要实验设备

4．2．2 主要实验药品

4．2．3 实验菌种

4．3 实验方法

4．3．1 BL21(DE3)-pETDuet-hppr-fdh及BL21(DE3)-pETDuet-dldh-fdh重组菌株的构建

4．3．2 全细胞催化剂的制备

4．3．5 BL21(DE3)-pETDuet-dldh-fdh制备SAA反应条件优化

4．3．6 SAA的制备

4．3．7 分析测定方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备DHPPA反应条件优化

4．4．2 DHPPA的制备

4．4．3 BL21(DE3)-pETDuet-hppr-fdh和BL21(DE3)-pETDuet-dldh-fdh重组菌株的构建

4．4．4 B121(DE3)-pETDuet-didh-fdh制备SAA反应条件优化

4．4．5 SAA的制备

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

硕士期间科研成果及奖项