基于化学探针与斑马鱼模型的中药活性成分筛选方法研究

摘要

中药药效物质研究是中药现代化进程重要内容。由于中药成分复杂，从中药混合物中筛选发现药效物质具有一定难度。本文建立了分子水平筛选与活体筛选相结合的中药活性成分筛选方法，着重研究了基于小分子化学探针和斑马鱼模型的3种中药活性物质筛选方法。
　　本论文研究内容主要包括:
　　1.建立了一种基于聚集诱导发光(AIE)效应探针的SIRT3调节剂筛选方法。设计了基于AIE效应的小分子探针，由一个作为荧光发色基团的四苯基乙烯(TPE)，与SIRT3酶能够识别的底物多肽Gln-Lys(Ac)-Arg-Phe-Asn通过固相合成得到。通过对体外反应体系的pH、缓冲盐浓度、探针浓度等因素的优化，该探针能够在体外特异性检测SIRT3活性，并具有较低的检测限。有望用于中药中SIRT3调节剂筛选。
　　2.建立了一种基于花生四烯酸诱导斑马鱼血栓模型的中药活性物质筛选方法，并用于丹红注射液活性成分筛选与质量评价。采用邻联茴香胺对斑马鱼心脏与尾部红细胞染色并获取血栓的显微图像，以心脏红细胞强度为指标评价血栓形成情况。结果表明，该模型能够较准确地评价阳性药阿司匹林的抗血栓活性。运用该方法评价了丹红注射液的抗血栓活性，发现丹红注射液能剂量依赖性地减轻花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓，丹参与红花提取物也有较好抗血栓活性。筛选出丹红注射液中迷迭香酸、对香豆酸等抗血栓活性成分，进一步结合对丹红注射液中化合物含量分析，发现迷迭香酸和对香豆酸可作为丹红注射液抗血栓活性相关质量标志物。并且该方法有望用于批次一致性评价。
　　3.建立了一种基于化学探针与斑马鱼血瘀血虚模型相结合的中药活性多重评价方法。对绿色荧光蛋白(GFP)标记血红蛋白的转基因斑马鱼用苯肼损伤，通过荧光成像获取血液流动情况来定性表征血瘀血虚证型。采用小分子探针NP3特异性地原位检测斑马鱼体内过氧化亚硝酸盐ONOO-，以探针荧光强度来描述斑马鱼氧化应激损伤和炎症程度，通过流式细胞术检测GFP标记的红细胞强度并以此为指标来评价血瘀血虚情况，实现了双重活性指标检测。运用该方法评价了丹红注射液及丹参、红花提取物的活性，表明丹红注射液能显著抗红细胞损伤和氧化损伤。该方法有望用于双重指标的中药活性成分筛选。

目录

声明

致谢

资助资金

摘要

1 绪论

1．1 中药活性成分筛选的研究背景与意义

1．2 中药活性成分筛选方法的研究进展

1．2．1 基于计算机技术的虚拟筛选

1．2．2 分子水平筛选方法

1．2．3 细胞水平筛选方法

1．2．4 整体水平筛选方法

1．3 模式生物斑马鱼在药物筛选与药理毒理研究中的应用现状

1．3．1 斑马鱼用于毒理研究

1．3．2 斑马鱼用于药理研究

1．3．3 斑马鱼用于药物筛选研究

1．4 本论文研究思路与内容

2 基于化学探针的SIRT3调节剂筛选方法研究

2．1 研究思路

2．2 试剂与仪器

2．3 实验方法

2．3．2 探针的合成

2．3．3 探针检测SIRT3活性的方法学研究

2．3．4 SIRT3与探针反应的最佳体系研究

2．3．5 反应体系中探针浓度优化

2．3．6 荧光探针对SIRT3蛋白的检测灵敏度研究

2．3．8 荧光探针用于SIRT3蛋白的体外筛选

2．3．9 统计学分析

2．4 实验结果

2．4．1 SIRT3识别肽段的发现与设计

2．4．2 多肽序列优化与探针的合成

2．4．3 探针检测SIRT3活性的方法学研究

2．4．4 SIRT3与探针反应的最佳体系研究

2．4．5 反应体系中探针浓度优化

2．4．6 荧光探针对SIRT3蛋白的检测灵敏度研究

2．4．7 荧光探针对SIRT3蛋白特异性研究

2．4．8 荧光探针对SIRT3调节剂的筛选结果

2．5 讨论与小结

3 基于花生四烯酸诱导斑马鱼血栓模型的筛选方法研究

3．1 研究思路

3．2 实验材料

3．2．1 斑马鱼培养

3．2．2 试剂与仪器

3．3 实验方法

3．3．1 花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓模型的建立

3．3．2 花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓模型的验证与表征

3．3．3 斑马鱼心脏红细胞强度分析

3．3．4 数据分析

3．3．5 变质丹红注射液样品的制备

3．3．6 丹红注射液中主要成分含量测定

3．4 实验结果

3．4．1 花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓模型的建立

3．4．2 丹红注射液组分在花生四烯酸诱导血栓模型上的活性评价

3．4．3 基于花生四烯酸诱导斑马鱼血栓模型的丹红注射液抗血栓活性化合物筛选

3．4．4 丹红注射液抗血栓活性化合物对香豆酸在斑马鱼血栓模型上的量．效关系

3．4．5 基于花生四烯酸诱导的斑马鱼血栓模型的丹红注射液质量标志物筛选

3．5 讨论与小结

4 基于化学探针与斑马鱼血瘀血虚模型的筛选方法研究

4．1 研究思路

4．2 实验材料

4．2．1 斑马鱼培养

4．2．2 试剂与仪器

4．3 实验方法

4．3．1 苯肼诱导的斑马鱼血瘀血虚模型的建立

4．3．2 斑马鱼显微镜下血流图像拍摄

4．3．3 流式细胞术统计斑马鱼红细胞数量

4．3．4 斑马鱼丙二醛(MDA)含量测定

4．3．5 斑马鱼体内ONOO-检测及定量分析

4．3．6 统计学分析

4．4 实验结果

4．4．1 苯肼诱导的斑马鱼血瘀血虚模型的建立

4．4．2 丹红注射液在苯肼诱导的斑马鱼血瘀血虚模型上量-效关系研究

4．4．3 斑马鱼体内MDA含量检测

4．4．4 斑马鱼体内ONOO-检测及定量分析

4．4．5 丹红注射液组分在苯肼诱导血瘀血虚模型上的活性评价

4．4．6 基于苯肼诱导的斑马鱼血瘀血虚模型的丹红注射液抗血瘀血虚活性化合物筛选

4．4．7 丹红注射液活性化合物的配伍活性研究

4．5 讨论与小结

5 总结与展望

参考文献

作者简历