深度挖掘肿瘤相关的DNA甲基化和tRNA来源小片段的分子特征

摘要

随着高通量测序技术的迅猛发展和测序成本的持续降低，海量的生物医学大数据呈现爆炸式增长，这给我们带来了机遇和挑战——如何挖掘这些海量数据背后的生物学意义。这篇博士论文主要目标是发展基于多种不同维度组学数据的整合策略来分析生物医学大数据，揭示肿瘤发生，发展和转移的机制，以期发现肿瘤中新的诊断和预后标记以及治疗靶点。 论文共分为四章。 第一章，引导和概述 第二章，我们发展了可用于RRBS基准化分析的模拟器，RRBSsim。通过利用肺癌实际RRBS数据和模拟产生的数据，我们全面综合地评估了7个RRBS的比对算法。我们的结果表明bwa-meth和BS Seeker2(bowtie2)的分析功效、准确性以及效率较高。同时，我们也发现了不同RRBS工具结果不一致的CpGs具有测序深度低，中等程度甲基化的特征或者其主要位于CpG岛岸和基因体内。因此，当前的RRBS工具并不能有效的分析这些CpGs，需要我们谨慎解读这些CpGs背后的生物学知识。我们的研究结果不仅可以帮助生物学家通过RRBS分析获得可靠的生物有关的预测结果，还可以为之后开发更加强大高效的RRBS工具提供强有力的指导和建议。 第三章，我们首次利用RRBS分析了了肺癌中单碱基水平的甲基化图谱特征。在我们的研究中，共鉴定9，234个DMRs，其中非小细胞肺癌中高甲基化DMRs4，410个，低甲基化DMRs4，824个。利用我们发展的甲基化驱动基因筛选方法，我们发现了8个新的甲基化驱动候选基因(PCDH17、IRX1、ITGA5、HSPB6、TBX5、ADCY8、GALNT13和TCTEX1D1)。TCGA数据和独立样本数据也证实了这8个基因在非小细胞肺癌中异常高甲基化。在肺癌细胞株中，其中5个基因（PCDH17、TCTEX1D1、GALNT13、ITGA5和HSPB6）的高甲基化可以被去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)所逆转，表明这些基因的表达抑制是由于其基因启动子区域高甲基化。此外，我们也进一步证实了PCDH17基因调控细胞增殖，与肿瘤形成发生发展有关。我们的研究结果获得了新的非小细胞肺癌差异甲基化区域以及甲基化驱动基因，为非小细胞肺癌中甲基化诊断标记物的筛选以及去甲基化治疗药物的开发提供了资源和基础。 第四章，基于TCGA的泛癌肿瘤测序大数据，我们发展了生物信息学方法来鉴定和量化肿瘤组织中的内源性tRNA来源的小RNA片段(即tRFs)。通过收集TCGA中15种肿瘤小RNA测序数据，共8，118份测序样本，我们系统地鉴定了肿瘤组织中的内源性tRFs，揭示了tRFs的基本生物学特性（包括表达模式、序列保守性、质核定位、剪切特异性、组织和细胞特异性等）。交叉肿瘤横向分析结果显示不同肿瘤类型的tRF表达亚型存在共性特征:例如，相比其它超级分子亚型，在3'-tRFs supercluster2中（由来自14个不同肿瘤类型分子亚型构成），一类22nt3'-tRF标签表达显著上调以及Ras/MAPK，RTK和TSC/mTOR等肿瘤信号激活。tRF分子亚型具有临床预后诊断意义，通过整合已有的临床决策变量可以显著提高病人的预后预测。此外，我们利用泛癌分析平台鉴定了11个超级肿瘤驱动tRFs，并着重验证了肺癌中tRNA来源的小RNA片段5'-IleAAT-20在临床诊断和预后中的意义。这些结果为深刻理解tRFs在肿瘤的分子机制提供了宝贵素材并为癌症诊治提供新的诊断、预后和作用靶点。

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摘要

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主要符号对照表

第一章绪论

1．1简化基因组甲基化测序(RRBS)

1．2 RRBS的比对软件

1．2．1 Wild-card法

1．2．2 Three-letter法

1．3 DNA甲基化和肺癌

1．4肿瘤中tRNA来源小RNA片段(tRFs)

第二章深度评估RRBS比对软件

2．1引言

2．2材料和方法

2．2．1 RRBS真实数据集

2．2．2 RRBS真实数据分析

2．2．3 RRBSsim产生模拟数据

2．3结果

2．3．1真实数据分析

2．3．2模拟数据分析

2．4讨论

2．5结论

第三章非小细胞肺癌单碱基甲基化图谱及鉴定新的甲基化驱动基因

3．1引言

3．2材料和方法

3．2．1 非小细胞肺癌组织样本

3．2．2 RRBS测序数据分析

3．2．3细胞生物学实验方法

3．2．4焦磷酸测序

3．3结果

3．3．1 非小细胞肺癌全基因组甲基化图谱特征

3．3．2非小细胞肺癌与癌旁组织差异甲基化区域特征分析

3．3．3非小细胞肺癌甲基化驱动基因的筛选及其功能特征

3．3．4基于TCGA数据对候选甲基化驱动基因验证结果

3．3．5独立的非小细胞肺癌组织和细胞验证新筛选出的甲基化驱动基因

3．3．6 PCDH17影响肺癌细胞增殖

3．4讨论

3．5结论

第四章人类癌症tRNA来源小RNA的大规模鉴别及综合图谱特征

4．1引言

4．2材料和方法

4．2．1 tRNA来源小RNA鉴别方法

4．2．2发展泛癌分析平台鉴定超级肿瘤驱动tRFs

4．2．3肺癌中5′-IleAAT-20的生物学功能研究

4．3结果

4．3．1 TCGA肿瘤组织中内源性tRFs的鉴定和量化

4．3．2 tRFs的亚细胞定位

4．3．3 tRFs是tRNA上特异性剪切产生的

4．3．4 tRFs在不同类型组织和细胞中的特异性表达

4．3．5大量tRFs在肿瘤组织中失调

4．3．6 tRFs分子亚型与肿瘤临床预后密切相关

4．3．7泛癌tRFs超级分子亚型及其特征

4．3．8发现肺癌驱动tRFs 5'-IleAAT-20

4．3．9敲低5'-IleAAT-20抑制肺癌细胞增殖和迁移侵袭

4．3．10敲低5'-IleAAT-20对于裸鼠成瘤的影响

4．3．11预测5'-IleAAT-20参与的生物过程和通路

4．3．12 RNA-Seq分析5'-IleAAT-20敲低的肺癌细胞株

4．3．13细胞实验证实5'-IleAAT-20调控细胞周期进展

4．4讨论

4．5结论

参考文献

附录

作者简历