嗜水气单胞菌生物被膜疫苗诱导的免疫反应

摘要

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，AH)在自然界中广泛分布，可致水产动物如中华鳖产生败血症等疾病，甚至大规模死亡，普遍认为疫苗是防治此病最安全有效的手段。注射类疫苗会引起诸如组织炎症、局部坏死等副作用，因此，从动物福利和人力成本方面考虑，黏膜途径接种疫苗，特别是口服途径，将是疫苗接种的理想方式，而口服疫苗因免疫效果低下等诸多因素而发展缓慢。生物被膜是细菌为适应环境在固着表面相互吸附而形成的微生物聚合体，包裹着自身分泌的胞外聚合物，是对抗生素或机体免疫系统的一种抵御机制，生物被膜口服后能保护抗原免受胃部环境的破坏，诱导机体产生特异性免疫。本文研究了嗜水气单胞菌生物被膜(Biofilm，BF)形成的条件优化以及生物被膜疫苗诱导小鼠、中华鳖（Pelodiscus sinensis）的免疫应答水平，并与游离菌(Free Cell，FC)比较，为防治中华鳖嗜水气单胞菌病提供新思路。
　　以微孔板结晶紫染色法研究了温度、葡萄糖、钙镁离子和人纤维蛋白原等对AH生物被膜形成的影响，优化了生物被膜的形成条件。结果显示，在25℃生物被膜形成量显著高于37℃(P＜0.01);添加葡萄糖浓度至2％(w/v)时，生物被膜的形成显著升高(P＜0.01)，达到时6％时显著下降(P＜0.05);添加CaCl2浓度至10mmol·L-1时，生物被膜显著上升(P＜0.01);MgCl2不同浓度间(0.1、1、10mmol·L-1)生物被膜形成无显著差异(P＞0.05)，与对照组亦无显著差异(P＞0.05);浓度为0.5、1.0、2.0和5.0mg·ml-1的人纤维蛋白原各组生物被膜形成量显著低于无添加组(P＜0.05)，说明人纤维蛋白原能抑制AH生物被膜的形成。
　　用注射和口服两种途径研究生物被膜诱导小鼠的免疫反应，注射试验组分别接种蜂胶苗、BF苗和FC苗，0.2ml/只，疫苗浓度为2×109cfu/ml，对照组注射生理盐水(normal saline，NS)，1周后加强免疫;结果显示，试验组蜂胶苗、BF、FC的血清抗体水平与对照组均有极显著差异（P＜0.01），BF的抗体水平高于FC，但差异不显著(P＞0.05)，低于蜂胶苗但无显著差异(P＞0.05);FC苗在免疫后35、42天抗体水平显著低于蜂胶苗(P＜0.05);免疫后30天腹腔注射攻毒，蜂胶苗和BF苗的相对保护率同为91.7％，FC组为83.3％;以上说明生物被膜的免疫水平与蜂胶苗相当，而游离菌免疫水平则低于蜂胶苗。口服免疫试验分为BF、FC和对照组，BF、FC苗分别与颗粒饲料混合均匀，连续饲喂10天，对照组投喂普通饲料;结果显示，BF与FC的抗体水平显著高于对照组(P＜0.05);BF的抗体水平显著高于FC(P＜0.05)，在免疫后14天和28天差异极显著(P＜0.01);免疫后10天，实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表达水平，BF组IL-10表达水平显著高于FC(P＜0.05)，IL-4、IL-12和IFN-γ的表达水平高于FC组，但无显著差异(P＞0.05);免疫后10天，MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平，BF组ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖水平显著高于FC组和对照组(P＜0.05);FC组与对照组在ConA刺激后增殖水平无显著差异（P＞0.05），在LPS刺激后，FC组显著高于对照组(P＜0.05);免疫后30天攻毒，BF组的保护率为63.6％，FC为45.5％;以上结果说明，口服免疫中生物被膜诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫水平高于游离菌。
　　用注射和灌胃途径研究生物被膜疫苗诱导中华鳖的免疫反应，注射免疫试验分为BF、FC和对照组，后肢肌肉注射0.3ml/只，2.4×109cfu/ml，对照组注射生理盐水，1周后加强免疫。结果显示BF、FC组血清抗体水平显著高于对照组(P＜0.05)，BF组抗体水平高于FC组，但无显著差异(P＞0.05)。首免后32天进行免疫保护实验，BF组和FC组中华鳖相对保护率均为83.3％。灌胃免疫试验分为BF、FC和对照组，疫苗浓度为5×1011cfu/ml，0.3ml/只，对照组用生理盐水灌胃，间隔6天以同样方法加强免疫两次;BF组血清抗体水平显著高于FC组(P＜0.05)，首免后第30和36天差异显著(P＜0.05);FC组血清抗体水平显著高于对照组(P＜0.05)，在第24和30天差异显著(P＜0.05);首免后32天进行免疫保护实验，BF组为保护率为50％，FC组为33.3％。
　　综上，优化嗜水气单胞菌生物被膜形成的条件后，可批量制备生物被膜用于动物试验;以小鼠为动物模型口服免疫嗜水气单胞菌生物被膜疫苗，抗体水平、保护率、淋巴细胞增殖水平和细胞因子表达水平皆高于游离菌;生物被膜灌胃免疫诱导中华鳖的抗体水平和保护率高于游离菌;以上结果表明生物被膜是一种很有前景的候选口服疫苗，其在中华鳖养殖的应用值得进一步研究。

目录

论文说明

声明

摘要

主要缩略词表

前言

第一部分 文献综述

第一章 生物被膜研究进展

1 生物被膜简介

2 生物被膜的形成原因

3 生物被膜形成的影响因素

4 生物被膜人工制备的方法

5 生物被膜的检测方法

6 生物被膜的功能特性

7 嗜水气单胞菌生物被膜

第二章 水产疫苗研究进展

1 注射类疫苗

2 浸泡疫苗

3 口服疫苗

4 中华鳖免疫

第二部分 试验研究

第三章 嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响因素

1 材料和方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第四章 嗜水气单胞菌生物被膜疫苗诱导小鼠的免疫反应

1 材料和方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第五章 嗜水气单胞菌生物被膜疫苗诱导中华鳖的免疫反应

1 材料和方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

全文总结

创新点

参考文献

附录

致谢