酿酒酵母生物合成香叶基香叶醇和β-紫罗兰酮的研究

摘要

香叶基香叶醇(geranylgeraniol，GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体，其生物活性构型为(E，E，E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E，E,E)-GGOH产量，在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶（BTS1-DPP1）和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg/L GGOH)的基础上，进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面，过表达了来源于红法夫酵母的GGPP合酶突变体（CrtE03M），增加了前体物质GGPP的供应，从而将GGOH产量提高了1.6倍，达到56.04mg/L;另一方面，利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调，从而使GGOH产量提高4.5倍，达到156mg/L。同时，通过敲除GAL80构建了葡萄糖调控的GAL体系，用以控制GGOH合成，与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起，构成了顺序表达体系，最终，以十二烷为有机相，在摇瓶中进行两相发酵，培养72小时后获得GGOH产量183.07mg/L，与初始菌株相比提高了5倍。随后本实验对菌株YWWP11-12DEE03(+)分批补料发酵。经过120 h发酵，最终发酵液OD600达到了310，最终产量为1.86 g/L。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。
　　除了香叶基香叶醇，本论文还以酿酒酵母作为底盘细胞对另一种萜类物质β-紫罗兰酮的生物合成进行了初步探索。β-紫罗兰酮在工业上是非常重要的香精香料。目前，β-紫罗兰酮主要来源于以柠檬醛为原料的化学合成。由于受健康生活观念的影响，消费者日益倾向于选择天然食用香料，因此对天然香料的市场需求不断增长，而微生物发酵生产得到的香料被视为“天然香料”。以课题组前期构建的高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株YXPW74为起始菌株，表达了来源于玫瑰的外源基因RdCCD1后，成功地检测到4.2 mg/Lβ-紫罗兰酮。对RdCCD1基因进行过表达后，β-紫罗兰酮仅略有提高（4.9 mg/L）。为了进一步促进β-胡萝卜素向β-紫罗兰酮转化，引入了来源于拟南芥的AtCCD7蛋白。为了检验RdCCD1蛋白和AtCCD7蛋白能否产生协同催化作用，分别构建了单独表达AtCCD7基因的菌株以及共表达RdCCD1和AtCCD7基因的菌株。结果表明单独表达AtCCD7基因的菌株产量仅仅为0.6 mg/L，并且过表达AtCCD7基因也不能显著提高产量;而共表达RdCCD1和AtCCD7基因的菌株产量达到了6.1 mg/L，与单独表达RdCCD1菌株相比，得到了明显的提高。结果表明，在酿酒酵母中CCD1蛋白和CCD7蛋白的确存在协同催化作用。由于两个酶的酶活均很低，在后续实验中还基于β-胡萝卜素和β-紫罗兰酮的颜色差异建立高通量筛选方法，对它们分别进行了定向进化，遗憾的是，并没有筛选到阳性突变体。本实验通过对CCD1和CCD7酶学性质分析，共表达RdCCD1和AtCCD7基因产生协同催化作用对合成生物学人工设计构建代谢途径有重要借鉴意义。

目录

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致谢

摘要

缩写词表

第一章 文献综述

1．1 生物合成法

1．2 香叶基香叶醇

1．3 β-紫罗兰酮

1．4 本课题研究内容及意义

第二章 基于关键节点代谢流重排提高酿酒酵母的香叶基香叶醇产量

2．1 前言

2．2 实验设备与材料

2．3 实验方法

2．4 实验结果与讨论

2．5 本章小结

第三章 香叶基香叶醇的高密度发酵

3．1 引言

3．2 实验设备和材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果与讨论

第四章 共表达RdCCD1和AtCCD7提高酿酒酵母中β-紫罗兰酮产量

4．1 引言

4．2 实验设备和材料

4．3 实验方法

4．4 实验结果和讨论

第五章 结论与展望

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果