来那度胺通过IL10--STAT3通路调控M2型巨噬细胞/T细胞交互作用治疗CNS自身免疫疾病的分子机制研究

摘要

研究目的: 多发性硬化症(MS)是由自身免疫系统介导的一种中枢神经系统(CNS)炎症性脱髓鞘疾病，其病理学特征主要表现为髓鞘破坏、炎性细胞浸润以及胶质增生，并且进展加重可能会导致瘫痪甚至死亡。研究发现，多种免疫细胞参与MS的进展，其中活化的CD4+T细胞可通过血脑屏障浸润CNS并释放炎性细胞因子以及趋化因子，招募T细胞、B细胞和巨噬细胞进一步浸润中枢，打破促炎因子和抑炎因子的平衡，导致少突胶质细胞和髓鞘损伤，最终诱发MS。 在前期研究中，我们已经通过药物筛选和巨噬细胞体外作用等方法证明来那度胺能促进巨噬细胞M2型极化，同时能缓解EAE模型小鼠的临床症状。然而，来那度胺是否作用于其它免疫细胞调控EAE疾病进展以及以何种作用形式参与其中，尚未有明确的报道。为进一步研究来那度胺保护EAE疾病的作用机制，本课题从细胞和整体动物层面运用多种模型和实验方法，探究来那度胺缓解EAE疾病中调控的免疫细胞类型及其分子作用机制。 研究方法: 1.来那度胺对EAE的治疗作用 (1)选用MOG35-55多肽诱导的实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型为研究对象，当出现约有20％的小鼠的尾巴末端肌力下降时开始灌胃给予试验药物来那度胺（30 mg/kg）和阳性药地塞米松（DXM，10 mg/kg），每天一次，连续给药18天，同时通过使用Kono's法对每天的EAE临床症状进行评分，从而明确来那度胺对EAE的治疗作用。(2)收取急性期（第17天）小鼠的外周免疫器官脾脏和引流淋巴结(DLN)，采用流式细胞术检测来那度胺对外周免疫器官中Th1、Th17、B细胞和Treg细胞的比例的影响。(3)收取造模后第17天小鼠的CNS中的脑和脊髓，用胶原酶消化和非连续密度梯度离心分离其中的单核细胞(MNCs)，通过细胞计数法对其进行计数，并采用流式细胞术检测来那度胺对MNCs中促炎性的Th1和Th17细胞的比例的影响。 2.巨噬细胞在来那度胺对EAE的治疗中的作用 (1)分离脾脏来源的T细胞，通过给予anti-CD3刺激其分化为髓鞘特异性CD4+T细胞，采用流式细胞术考察来那度胺处理对髓鞘特异性CD4+T细胞中Th1和Th17细胞比例的影响。(2)采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CD4+T细胞并通过流式细胞术检测CFSE衰减的CD4+T细胞比例。(3)从MOG处理的野生型小鼠中分离脾脏来源的CD4+T细胞，经CSFE标记后以1∶4的比例与来那度胺处理后的BMDMs共培养，通过流式细胞术检测CFSE衰减的CD4+T细胞比例。(4)在造模后第7、8、11、12、15、16天分别通过尾静脉注射给予50mg/kg的氯磷酸盐脂质体及其空载脂质体对照，通过使用Kono's法对EAE临床症状进行评分，从而明确巨噬细胞对来那度胺治疗EAE的效果的影响。(5)采用流式细胞术检测造模后第17天模型组和来那度胺给药组EAE小鼠脾脏和DLN中M2型和M1型巨噬细胞的比例。(6)采用流式细胞术检测造模后第17天模型组和来那度胺给药组EAE小鼠CNS中M2型巨噬细胞的比例。(7)采用流式细胞术验证来那度胺对巨噬细胞极化的影响。(8)在造模后第9、14和19天尾静脉回输未经或经来那度胺处理的BMDMs，通过使用Kono's法对EAE临床症状进行评分，从而明确来那度胺诱导的巨噬细胞对治疗EAE效果的影响。 3.M2型巨噬细胞分泌IL10介导来那度胺的治疗作用 (1)采用Real-time PCR检测来那度胺处理后BMDMs中Il4、Il10、Il13和Tgf-β相对表达水平的变化。(2)采用ELISA检测造模后第17天来那度胺对EAE小鼠血清和脾脏、脊髓中的IL10分泌的影响。(3)采用流式细胞术检测造模后第17天来那度胺对脾脏和DLN中CD206+ IL10+的巨噬细胞比例的影响。(4)从野生型小鼠和Il10-/-小鼠中分离BMDMs，采用western blotting检测来那度胺对M2型巨噬细胞基因Ym1的蛋白水平影响。(5)采用野生型和Il10-/-小鼠构建EAE疾病模型，通过使用Kono's法对EAE临床症状进行评分，从而明确IL10缺失对来那度胺抑制EAE疾病进展作用的影响。(6)采用MBP免疫组化和LFB染色考察造模后第15天来那度胺处理的野生型和Il10-/-EAE造模小鼠脊髓髓鞘变化差异。(7)在造模后第12天尾静脉回输未经处理的野生型BMDMs、经来那度胺处理的野生型BMDMs或经来那度胺处理的Il10-/-BMDMs，通过使用Kono's法对EAE临床症状进行评分，从而明确巨噬细胞IL10缺失对来那度胺治疗EAE的效果的影响。 4.来那度胺通过IL10-STAT3信号通路调控M2型巨噬细胞极化 (1)采用western blotting考察来那度胺作用于RAW264.7和BMDMs细胞对STAT6、AKT和STAT3的激活情况的差异。(2)采用western blotting考察来那度胺作用于RAW264.7和BMDMs细胞不同时间对IL10和p-STAT3的蛋白水平变化的先后差异。(3)采用ELISA检测考察来那度胺作用于RAW264.7和BMDMs细胞后上清中IL10细胞因子分泌水平的变化。(4)采用IL10抗体中和IL10后考察来那度胺对p-STAT3和Ym1表达水平影响的差异。(5)采用STAT3抑制剂Cucurbitacin(CuCu)抑制STAT3后考察来那度胺对p-STAT3和Ym1表达水平影响的差异。 研究结果: 1.来那度胺对EAE的治疗作用 (1)在构建慢性小鼠EAE模型后，通过给予造模小鼠30 mg/kg来那度胺和10mg/kg阳性药地塞米松(DXM)后，发现阳性药DXM组小鼠在造模后第11天后打分明显低于模型对照组，其急性期（第17天）打分为0.67±0.15分(p＜0.001)，而来那度胺组小鼠也在造模后第11天开始打分明显低于模型对照组，其第17天打分为1.17±0.30分(p＜0.001)。(2)在构建慢性小鼠EAE模型后第8天开始灌胃给予30 mg/kg来那度胺，通过在急性期第17天检测小鼠脾脏和DLN中的IFNγ+CD4+T(Th1)和IL17+ CD4+T(Th17)细胞比例，发现与模型对照组相比，来那度胺给药能明显下调脾脏中Th1细胞的比例(15.81±0.97％到5.58±0.57％，p＜0.001)以及Th17细胞的比例（13.03±0.93％到4.63±0.21％，p＜0.001），同时能下调DLN中的Th1细胞的比例（12.18±0.92％到5.28±0.47％，p＜0.001）以及Th17细胞的比例（15.69±1.11％到5.53±0.36％，p＜0.001）。(3)在第17天检测EAE小鼠脾脏和DLN中B220+B和表达CD4+ Foxp3+的Treg细胞，发现来那度胺给药后脾脏和DLN中B细胞均未发生明显变化（15.62±0.72％到14.40±0.69％，p=0.2501;29.29±1.25％到25.65±1.39％，p=0.0797），同时脾脏和DLN中Treg细胞也未发生明显变化（14.53±1.04％到16.52±1.49％，p=0.3000;14.93±0.96％到17.71±1.06％，p=0.0806）。(4)在第17天分离EAE小鼠CNS中的单核细胞并计数，结果显示来那度胺给药后单核细胞数量发生明显下降（46.67±2.96万到19.47±1.80万个，p＜0.001）。(5)在第17天检测EAE小鼠CNS中Th1和Th17细胞的比例，结果显示给予来那度胺后能明显下调CNS中Th1和Th17的细胞比例（5.77±0.51％到2.51±0.36％，p＜0.001;6.01±0.69％到2.83±0.38％，p＜0.001）。以上实验结果表明，来那度胺具有缓解EAE疾病进展的作用，并能减少EAE外周免疫器官和CNS中Th1和Th17的细胞比例，提示来那度胺能抑制CNS自身免疫应答从而抑制炎症和EAE进展。 2.巨噬细胞在来那度胺对EAE的治疗中的作用 (1)通过体外来那度胺直接作用于CD4+T细胞，发现来那度胺对增殖的CD4+T细胞比例不存在明显影响（6.19±1.29％到7.19±0.91％，p=0.1238）。(2)通过体外共培养来那度胺处理的BMDMs和CD4+T细胞，结果显示来那度胺处理后的BMDMs可明显下调增殖的CD4+T细胞比例(7.53±0.35％到4.36±0.34％，p＜0.01)。(3)在构建慢性小鼠EAE模型后并给予氯磷酸盐脂质体清除体内巨噬细胞，结果显示清除巨噬细胞后，来那度胺给药并不能缓解EAE病情进展，其临床打分和单用脂质体的氯磷酸盐脂质体组以及空载脂质体组均相似，不存在显著性差异(p＞0.05)。(4)在造模后第17天检测EAE小鼠脾脏和DLN中M2型(F4/80+CD206+)和M1型(F4/80+ CD86+)巨噬细胞比例，结果发现给予来那度胺后能明显上调脾脏中M2型巨噬细胞的比例（15.99±1.14％到30.81±2.48％，p＜0.001），但其对脾脏中M1型巨噬细胞比例不产生影响(32.72±1.54％到28.47±1.20％，p=0.0544);在DLN中结果与脾脏相似（M2，14.47±1.02％到26.82±2.49％，p＜0.01;M1，19.85±1.83％到18.76±1.49％，p=0.6529）。(5)在第17天检测EAE小鼠CNS中M2型(CD11b+ CD45hi CD206+)巨噬细胞比例，结果显示来那度胺能明显上调CNS中M2型巨噬细胞的比例（3.94±0.31％到8.36±0.61％，p＜0.001）。(6)分离小鼠BMDMs后验证来那度胺促M2表型，发现来那度胺作用4h可以明显提高BMDMs中M2型细胞的比例（20.22±2.06％到48.96±5.54％，p＜0.01），而对M1型细胞比例不产生明显影响（18.45±1.73％到21.22±2.15％，p=0.3241）。(7)在构建慢性小鼠EAE模型后并回输来那度胺处理的BMDMs，结果显示从第15天开始，来那度胺处理的BMDMs组的EAE临床打分（1.44±0.13分）明显下调，与对照组（2.18±0.22分）存在显著性差异(p＜0.01)。在EAE发病急性期第18天，来那度胺BMDMs组的临床打分（1.93±0.31分）明显低于对照BMDMs组（2.90±0.08分），存在显著性差异(p＜0.001)。以上实验结果显示，M2型巨噬细胞极化在来那度胺发挥对EAE的治疗作用中起关键作用。来那度胺不直接作用于T细胞，而是通过调控M2型巨噬细胞/T细胞交互作用抑制CNS自身免疫反应，抑制CNS炎症并保护髓鞘。 3.M2型巨噬细胞分泌IL10介导来那度胺的治疗作用 (1)在BMDMs上作用来那度胺25 nM，4h后收样，qRT-PCR检测Il4、Il10、Il13和Tgf-β表达水平。结果显示，来那度胺可以显著上调Il4、Il13和Tgf-β的mRNA水平，其中Il4上调7.41±0.80倍(p＜0.01)，Il13上调5.63±0.51倍(p＜0.01)以及Tgf-β上调13.96±1.30倍(p＜0.01)。尤其是Il10 mRNA水平上调27.70±1.32倍(p＜0.001)。(2)在构建慢性小鼠EAE模型后第17天ELISA检测外周血、脾脏和脊髓中的IL10分泌情况。结果显示，血清中IL10水平从65.00±4.36pg/mL上调至125.00±4.36 pg/mL(p＜0.001)，脾脏中IL10水平从3.18±0.27pg/mg protein上调至7.25±0.65 pg/mg protein(p＜0.01)，而脊髓中的IL10分泌水平从18.86±1.15 pg

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1引言

2实验材料与仪器

2．1细胞株

2．2实验动物

2．3药物与试剂

2．4实验仪器

3实验方法

3．1细胞培养

3．2分离诱导及培养原代小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)

3．3小鼠单细胞分离和流式细胞术检测

3．4流式细胞术

3．6巨噬细胞清除和回输

3．7巨噬细胞和T细胞共培养

3．8 Real-time PCR

3．9 ELISA测定IL10分泌水平

3．10免疫组化

3．11LFB染色

3．12Western blotting

3．13数据分析

4实验结果

4．1来那度胺对EAE的治疗作用

4．1．1来那度胺能缓解EAE疾病进展

4．1．2来那度胺能抑制外周促炎性的Th1和Th17细胞应答

4．1．3来那度胺不能抑制外周B细胞和Treg细胞免疫应答

4．1．4来那度胺能抑制中枢神经系统中炎性细胞的浸润

4．2巨噬细胞在来那度胺对EAE的治疗中的作用

4．2．1来那度胺通过调控巨噬细胞间接抑制T细胞免疫应答

4．2．2来那度胺对EAE的治疗作用依赖于巨噬细胞

4．2．3来那度胺能促进外周免疫器官中的M2型巨噬细胞表达

4．2．4来那度胺能促进CNS M2型巨噬细胞表达

4．2．5来那度胺对EAE的治疗作用依赖于M2表型

4．3 M2型巨噬细胞分泌IL10介导来那度胺的治疗作用

4．3．1来那度胺能上调IL10的表达和分泌

4．3．2来那度胺上调的IL10主要来源于M2巨噬细胞

4．3．3 IL10缺失阻断来那度胺对EAE疾病的保护作用

4．4来那度胺通过IL10-STAT3信号通路调控M2型巨噬细胞极化

4．4．1来那度胺能上调IL10表达并促进STAT3磷酸化

4．4．2来那度胺促进M2巨噬细胞极化依赖于IL10

4．4．3 来那度胺促进M2巨噬细胞极化依赖于STAT3磷酸化

5讨论

参考文献

综述 调控巨噬细胞M2极化治疗多发性硬化症的研究进展

作者简历及硕士期间科研成果