基于巨噬细胞极化表型筛选吡唑联苯基酰胺治疗脑脊髓炎的分子机制研究

摘要

研究目的: 多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)是临床常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病，其病理进程可引起脑和脊髓的损伤进而严重影响患者的生存质量。目前临床上采取的治疗手段如免疫调节剂芬戈莫德只能在一定程度上延缓疾病进展，无法从根本上修复受损髓鞘和预防炎症。M1型极化的巨噬细胞分泌炎性因子导致炎症的发生，而M2型极化的巨噬细胞则有利于髓鞘和轴突的修复，并有抑制炎症的作用，从而兼具髓鞘修复和免疫调控的作用。本课题通过实验室内部的化合物库筛选得到促进巨噬细胞M2型极化的新型化合物骨架结构，并对这种化合物骨架进行结构优化，研究其对多发性硬化症的治疗作用和分子机制。 研究方法: 1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选: 1) RAW264.7小鼠巨噬细胞株给予具有不同骨架的化合物，单独作用24h采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg1和M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;2) RAW264.7小鼠巨噬细胞株预先用LPS刺激24h后给予具有不同骨架的化合物作用24h，采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;3）原代巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophages，BMDMs）经筛选及优化得到的D11作用24h后，采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg1，Mrc1和Fizz1及M1型基因Inos，Mcp1和Cd86的mRNA变化水平，采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞(CD206+ F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;4）BMDMs预先用LPS刺激24h后，给予D11作用24h，采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Inos，Mcp1和Cd86的mRNA变化水平，采用流式细胞术检测M1型巨噬细胞(CD86+ F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例。 2.D11对树突细胞成熟和CD4+T细胞增殖分化的影响: 1)采用流式细胞术检测BMDCs经D11作用24h和对照组成熟的树突细胞(MHC-Ⅱ+ CD11C+)和(CD80+ CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;2）采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测BMDCs经D11作用24h后和对照组细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;3）用na(i)ve CD4+T细胞分离试剂盒从C57BL/6小鼠淋巴结中分离幼稚CD4+T细胞，加入anti-CD3(1μg/ml)，anti-CD28(5μg/ml)，在1640培养基+10％FBS中培养72h，在最后24h加入D11，流式检测Th1诱导条件下(IL-121μg/ml) Th1细胞（CD4+ IFN-γ+）占CD4+T细胞的比例及Th17诱导条件下（IL-62.5 ng/ml、TGF-β1 ng/ml）Th17细胞(CD4+ IL-17+)占CD4+T细胞的比例;4）BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+T细胞共培养48h，流式检测增殖的CD4+T细胞占CD4+细胞的比例。 3.D11药代动力学研究: 选择检疫合格SD大鼠8只（雌雄各半），分成2组，即D11灌胃组和D11静脉注射组，每组4只SD大鼠，雌雄各半。灌胃组于灌胃前和灌胃后10 min、30 min、1h、2h、3h、4h、8h、24 h和48 h分别尾静脉取血，每只动物每次采血量不多于0.2 ml。静注组于给药前和给药后5 min、15 min、30 min、1h、2h、4h、8h、24 h和48 h分别取血，每只动物每次采血量不多于0.2 ml。取血浆样品，加入3倍量含内标0.20μg/ml的甲醇液沉淀蛋白，涡漩10 min，10000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。LC-MS分析采用正离子方式检测。将所得浓度-时间数据，用DAS3.0药代动力学软件，采用统计矩法进行计算，得到大鼠灌胃和静注给予D11后主要吸收动力学参数AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax、Tmax等。 4.D11对MS小鼠模型EAE的治疗作用及机制研究: 选择检疫合格C57BL/6小鼠，使用MOG35-55诱导经典的MS小鼠模型EAE，从造模第8天开始，每天1天，连续19天灌胃给于不同剂量的D11。1）采用Kono's法每天对各组EAE造模小鼠的临床症状打分，并每天记录各组小鼠的体重变化;2)采用苏木精-伊红(Hematoxylin&Erosin，HE)和坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色评价D11对小鼠脊髓炎性和髓鞘损伤的保护作用;3）采用流式细胞术检测EAE小鼠体内Th1细胞（CD4+ IFN-γ+）和Th17细胞(CD4+IL-17+)占CD4+T细胞的比例;4）采用流式细胞术检测小鼠体内M1(CD86+F4/80+)型和M2型(CD206+F4/80+)巨噬细胞在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;5）采用流式细胞术检测小鼠体内成熟的树突细胞(MHC-Ⅱ+ CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;6）采用流式细胞术检测小鼠体内Treg细胞(CD4+ FOXP3+)占CD4+T细胞的比例。 5.D11促进巨噬细胞M2型极化机制研究: 1)采用基因芯片技术(microarray)分析D11给药和对照组的巨噬细胞基因组表达水平;2）采用Western Blot技术检测D11给药后STAT3，AKT和STAT6的激活情况;3）采用流式细胞术检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠来源BMDMs的M1和M2型分别在巨噬细胞中所占比例;4）采用流式细胞术检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠来源BMDCs成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;5）采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测Lysm creSTAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠来源BMDCs细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;6）对Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠进行EAE造模，每日进行临床症状打分，并每天记录两组小鼠的体重变化;7）采用流式细胞术检测小鼠体内M1型和M2型巨噬细胞在巨噬细胞中所占比例及成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;8）采用流式细胞术检测小鼠中枢免疫器官中外周浸润巨噬细胞(CD45hiCD11bhi)和小胶质细胞(CD45intCD11bhi) M1型和M2型所占比例。 研究结果: 1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选 28种具有代表性的结构骨架化合物（S-1～S-28）分别作用Raw264.724h后，S-2、S-9、S-11、S-28可显著促进巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA表达(p＜0.05，n=3，上调倍数:S-2:7.3倍、S-9:8.1倍、S-11:7.0倍、S-28:10.1倍)， S-9、S-13、S-16、S-18可显著促进巨噬细胞M1型基因Mcp1 mRNA表达(p＜0.05，n=3，上调倍数:S-9:3.3倍、S-13:3.0倍、S-16:2.7倍、S-18:3.5倍)。基于相似性从Molport数据库搜索得到的S-28结构类似物(A1～A10)分别作用Raw264.724h后，A2可显著促进巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA表达(p＜0.05，n=3，上调倍数:A2:4.9倍)但作用弱于S-28，巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p＞0.05，n=3)。S-28的手性化合物B1作用Raw264.724h后，巨噬细胞M2型基因Arg1，M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p＞0.05，n=3)。S-28的a-b环及c-d环结构类似物(C1～C11)分别作用Raw264.724h后，巨噬细胞M2型基因Arg1， M1型基因Mcp1 mRNA表达无明显变化(p＞0.05，n=3)。 S-28的不同取代基化合物(D1～D21)分别作用Raw264.724h后，D8、D9、D10、D11、D12、D13、D15可显著促进巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA表达(p＜0.05，n=3，上调倍数:D8:10.1倍、D9:8.4倍、D10:6.5倍、D11:14.0倍、D12:10.1倍、D13:5.1倍、D15:10.3倍），D14、D15、D16可显著促进巨噬细胞M1型基因Mcp1 mRNA表达(p＜0.05，n=3，上调倍数:D14:4.85倍、D15:3.54倍、D16:5.08倍)。 2.D11对树突细胞成熟和CD4+T细胞增殖分化的影响 流式检测结果显示，化合物D11作用原代树突细胞BMDCs24h后，分化成熟的树突细胞(CD80+ CD11C+)、(MHC-Ⅱ+ CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例没有发生明显变化(p＞0.05，n=3)。ELISA结果显示，成熟树突细胞分泌的细胞因子IL-6和IL-12在D11给药后也没有发生明显变化(p＞0.05，n=3)。化合物D11作用CD4+T细胞24h，CD4+T细胞分化成Th1(CD4+ IFN-γ+)和Th17(CD4+IL-17+)均没有明显受到药物的影响(p＞0.05，n=3)。BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+T细胞共培养48h，增殖的CD4+T细胞占总CD4+细胞的比例显著降低(p＜0.05，n=3)。且CD4+T细胞和BMDMs共培养的上清液中炎性因子IFN-γ和IL-17的浓度显著降低(p＜0.05，n=3)。 3.D11药代动力学研究 在大鼠中进行D1150 mg/kg单剂量药代动力学研究，D11在大鼠中表现出良好的绝对口服生物利用度，F值为50.63％。在此外，D11显示出的药物半衰期和口服吸收度表明D11具有良好的口服成药性(t1/2=3.3 h，Cmax=313 ng/mL，AUC0-t=4669 ng/mL·h)。 4.D11缓解EAE小鼠的疾病进展 在小鼠EAE造模后第8天，20％的小鼠开始出现尾梢疲软的EAE早期症状，将小鼠进行随机分组，并从此天开始对阳性药地塞米松组（10 mg/kg）和D11组（100 mg/kg，200 mg/kg）进行给药，对所有造模小鼠每天打分并称重。在造模后第11天，EAE模型组小鼠临床症状打分平均达到1.7±0.2分，阳性药地塞米松组和D11200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.3±0.1分和0.5±0.1分，显著低于EAE模型组(p＜0.01，n=5)，而D11100 mg/kg组临床症状打分平均为1.1±0.2分，低于EAE模型组，但无显著性(p＞0.05，n=5)。在造模后第17天，EAE模型组小鼠临床症状打分平均到达峰值，为3.3±0.1分，此时阳性药地塞米松组和D11200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.7±0.1分和1.3±0.2分，显著低于EAE模型组(p＜0.001，n=5)，而D11100 mg/kg组临床症状打分平均为3.1±0.1分，与EAE模型组相比无明显差别(p＞0.05，n=5)。另一方面，EAE模型组和D11100 mg/kg组小鼠在造模后体重逐渐减轻，在疾病峰期后体重回升，而阳性药地塞米松组和D11200 mg/kg组小鼠体重相对稳定。以上结果提示，D11(200 mg/kg)治疗给药可缓解EAE发病进程，改善EAE造模小鼠的运动功能障碍，并维持EAE小鼠的体重稳定。 5.D11减轻EAE小鼠脊髓中的炎性反应和髓鞘损伤 HE染色结果显示，EAE小鼠疾病峰期（第17天），模型组小鼠脊髓白质区可见大量的炎性细胞浸润，而D11（200 mg/kg）治疗给药组小鼠脊髓中无明显炎