不同Bt抗虫基因对水稻的复合转化和绿色组织特异表达型抗虫水稻的检测与验证

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，而鳞翅目昆虫如螟虫等是水稻生产中的主要虫害，常规的农药防治螟虫不但增加成本投入，而且还容易诱使昆虫产生抗药性。基于单一抗虫基因容易使昆虫产生抗性以及公众对于转基因水稻食用安全性过度担忧的现状，本文从以下两方面开展了研究:聚合两个不同的抗虫基因以培育持久抗虫水稻新材料;对已有转化体进行鉴定和分析以尽快获得我们期望的胚乳零表达型抗虫水稻新材料，并取得了如下研究结果: 一、绿色组织特异表达性抗虫水稻新材料的检测与验证 利用PCR技术从12个不同的转化体中获得8个纯合的转基因株系。通过Southern杂交，筛选到5个单拷贝的材料。对5个转化系中的Cry1Ab/1Ac蛋白进行定量分析，结果显示:在分蘖期和灌浆期叶片和茎秆中，5个转化系均能检测到抗虫蛋白，叶片中的表达量显著高于茎秆。五个转化系的Cry1Ab/1Ac蛋白含量在整体水平上比阳性对照浙优3号高，部分转化系叶片中的表达量比对照甚至高出10倍左右。在胚乳中，在各转化系内检测值与阴性对照之间没有显著差异，显著低于浙优3号的0.23μg/g。此外，田间对转基因植株进行抗虫鉴定，结果显示野生型对照在人工接虫二化螟后单株分蘖受危害率高达68.04％，自然感虫稻纵卷叶螟后单株受危害叶片数达到24片;而转基因植株受二化螟危害比例均低于2.88％，受卷叶螟单株受危害叶片不高于0.37片。表明转基因植株对螟虫具有高度的抗性。因此，在绿色组织特异表达型抗虫水稻新材料中，Cry1Ab/1Ac蛋白在叶片和茎秆等绿色组织中大量且稳定地表达，在胚乳中低表达或不表达，实现了预期的效果。 二、通过复合遗传转化聚合Cry和Vip两个不同Bt抗虫基因 通过农杆菌介导法将Vip3ArLr1基因转化到携带Cry1Ab/1Ac抗虫基因的两系光温敏不育系208S中，共获得40株绿苗。Southern杂交结果显示40株绿苗中只有1株携带Vip3ArLr1基因，这代表了一个转化体，但因发现一些农艺性状有缺陷，相应的表型鉴定需要等到回交改良成功之后再进行。

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摘要

图表索引

缩略词表

1文献综述

1．1引言

1．2水稻抗虫基因

1．2．1 ICP杀虫蛋白

1．2．2 Vip杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，Vips)

1．3双价抗虫转基因植物研究进展

1．4组织特异性启动子

1．4．1绿色组织特异性启动子

1．4．2 rbcS启动子

1．5转运肽(transit peptides)

1．6本研究目的和意义

2绿色组织特异表达型抗虫水稻的检测与验证

2．1引言

2．2实验材料

2．2．1水稻材料

2．2．2载体和菌株

2．2．3主要试剂、酶和引物

2．3实验方法

2．3．1 CTAB法抽提水稻基因组DNA

2．3．2 PCR检测

2．3．3 Southern杂交检测

2．3．4抗虫蛋白含量测定

2．3．5田间材料种植及抗虫性鉴定

2．3．6农艺性状考察

2．4结果与分析

2．4．1载体构建及水稻遗传转化

2．4．2目标基因鉴定及Southern杂交分析

2．4．3转化系中抗虫蛋白含量分析

2．4．4田间抗虫性鉴定结果

2．3．5农艺性状考察结果

2．5讨论

3通过复合遗传转化聚合Cry和Vip两个不同Bt抗虫基因

3．1引言

3．2实验材料

3．2．1水稻受体材料

3．2．2载体和菌株

3．2．3主要试剂、酶和引物

3．3实验方法

3．3．1农杆菌介导的水稻遗传转化

3．3．2 CTAB法抽提水稻基因组DNA

3．3．3 PCR检测

3．3．4 Southern杂交检测

3．4结果与分析

3．4．1水稻遗传转化

3．4．2目的基因的分子鉴定

3．4．3转化系拷贝数鉴定

3．5讨论

4全文总结及展望

参考文献

附录

致谢