小鼠肝细胞胰岛素信号转导系统的动力学研究

摘要

目的：初步建立研究信号转导磷蛋白质组的方法，并应用此方法初步鉴定几种作为小鼠肝细胞胰岛素信号转导系统的组成成分或效应蛋白/酶的磷蛋白，对这些磷蛋白在持续高浓度的胰岛素刺激不同时间点的磷酸化水平进行半定量分析（获得相对反应速度数据），在细胞整体水平观察细胞内的激酶、信号蛋白在胰岛素信号转导过程中发生的动力学变化，以确定信号蛋白、信号途径之间的相互交流、相互影响、相互作用和相互制约的关系及其对信号转导最终生理效应的影响；方法：本实验采用组织块培养法，原代培养小鼠肝细胞作为实验材料，32P同位素标记对照组与刺激组小鼠肝细胞磷蛋白，给予刺激组胰岛素（100nmol/L）分别作用0min、5min、20min、60min、120min等不同时间长度，液氮终止反应，裂解细胞，收集蛋白，Bio-Rad DC法定量蛋白，根据蛋白质的等电点和分子量的不同采用双向电泳（一向采用pH3-10的固相pH梯度等电聚焦，二向采用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离所得蛋白，固定凝胶块后进行干胶，将干好的胶与X胶片一起放入摄影暗匣，在-70oC冰箱中曝光7日，于自动洗片机内冲洗X光胶片可得自显影片，获得电泳图谱。采用PDQuest 2D分析软件分析电泳图谱中磷蛋白的等电点及分子量，将实验所得磷蛋白质点与Swiss-Prot/TrEMBL蛋白质数据库、PPDB及自建磷蛋白数据库中小鼠肝细胞磷蛋白质进行分子量、等电点及磷酸化状态的相互比较，初步确定小鼠肝细胞胰岛素信号转导系统的组成成分或效应蛋白/酶等相关磷蛋白，采用PDQuest 2D分析软件分析胰岛素刺激不同时间点，蛋白质磷酸化水平的变化，并绘制出相应的时间动力学曲线。结果：初步确定小鼠肝细胞胰岛素信号转导相关磷蛋白有EGFR底物15、信号转导子、热休克蛋白86、磷脂酰肌醇3激酶α调节亚基、蛋白激酶Cα、SHC、蛋白激酶B （PKB）、磷脂酰肌醇3激酶γ调节亚基、MAPK 信号整合激酶1、MAPK磷酸酶3、14-3-3蛋白α/β，糖代谢相关蛋白有糖原合酶底物（Glycogenin-1）等；获得磷蛋白Shc、PKB、MAPK磷酸酶3、Glycogenin-1、14-3-3α/β等的时间动力学曲线，曲线均呈峰型，其中MAPK磷酸酶3的曲线高峰在5min ，Shc、PKB、Glycogenin-1、14-3-3α/β的曲线高峰在20min。结论：在细胞整体水平，持续高浓度的胰岛素刺激下，磷蛋白不再表现为在纯化体系时呈现的持续激活状态，而是激活后很快恢复至低水平磷酸化状态，表明在细胞整体水平，每个磷蛋白表现的动力学行为是受到整个信号转导系统整合后的动力学行为，从而可以认为，胰岛素信号转导途径之间存在相互交流，并且这种相互作用对其产生最终效应有影响；在细胞水平，由于这种相互交流，信号转导系统产生了新的系统特性，使细胞对持续高浓度的胰岛素刺激产生了自适应控制性。