玉环柚果实成熟过程中不同部位芳香物质分布及合成相关TPS基因鉴别

摘要

柚（Citrus grandis）是柑橘基本种之一，在柑橘产业上具有重要的经济地位。中国是柚的原产国和主要栽培国家，种质资源丰富，产量和种植面积均居世界首位。我国的柚栽培历史悠久，种植区域广泛，形成了丰富的地区特色品种，比如浙江的玉环柚。香气是柚重要的品质指标，提取的精油在各个行业广泛使用。根据组织的差异，柚果实的结构主要包括油胞层、白皮层、囊衣和汁胞等部位。目前，关于柚果实成熟过程中不同部位的芳香物质分布及合成基因尚不清楚。本文以玉环柚为材料开展相关研究，主要结果如下: (1)从玉环柚果实中鉴别出64种芳香物质，主要包括单萜、单萜氧化物、倍半萜、倍半萜氧化物、苯丙类、醛、醇和酯类等物质。对比已有文献，15种芳香物质是第一次在柚果实中报道。Venn分析结果显示，在油胞层、白皮层、囊衣和汁胞中可以同时检测到的芳香物质有26种。在油胞层中特异性检测到的物质有12种，在白皮中特异性检测到反式-松香芹醇和紫苏醇，反式-2-辛烯醛特异性在汁胞中检测到。囊衣组织中并没有特征芳香物质，其检测到的39种物质均可以在果实的其他三个部位中存在。 (2)果实的芳香物质含量以油胞层最高，物质种类以单萜烯类为主，柠檬烯是含量最丰富的物质。通过物质含量的比较，发现51种物质主要在油胞层中积累，7种物质在白皮层中含量最高，2种物质主要在囊衣中富集，另外4种物质则在汁胞中含量最高。在果实成熟期(200DAB)，油胞层芳香物质总含量为80009.87μg/g FW，约为白皮层，囊衣和汁胞三个部位总和的1000倍。单萜烯类在油胞层中的含量为75695.44μ g/g FW，约占芳香物质总合量的94.61％。柠檬烯、月桂烯、β-蒎烯、罗勒烯和香叶醛是油胞层中含量最高的5种芳香物质，其中柠檬烯的含量为45981.77μg/gFW，约占芳香物质总合量的57.47％。对于果实的白皮层、囊衣和汁胞而言，在果实成熟期的200DAB，单萜烯类的相对含量分别为77.12％,79.24％和67.43％,其中柠檬烯的相对含量分别为52.67％，55.26％和46.22％。利用芳香物质作为变量开展PCA分析，可区分成熟过程中不同部位的果实组织。在不同成熟阶段的PCA图中，来自于果实的油胞层主要在PC1左侧的正半轴富集，来源于白皮层、囊衣和汁胞等部位的样品主要在PC1的负半轴。果实汁胞的芳香物质受发育阶段影响较大，不同成熟阶段的组织在PCA中具有不同分布。 (3)果实成熟过程中的芳香物质总量呈现增加趋势，但不同部位之间的模式存在差异。果实从80DAB(约650g)到200DAB（约1940g）的成熟过程中，芳香物质总量从47990.79μg/g FW增加到80093.61μg/g FW。油胞层芳香物质总量增加大约1.67倍，白皮层增加大约5.66倍，囊衣部位并没有发生显著变化。不同于其它部位，汁胞中的芳香物质总合量随着果实的成熟逐渐降低，在果实成熟阶段的含量约为幼果期的9％。含量最为丰富的单萜类物质，在油胞层中的含量从80DAB果实的43237.35μg/g FW增加到了200DAB的75695.44μg/g FW，在汁胞中的含量则由50.09μg/g FW减少到了4.24μg/g FW。对于含量最高的柠檬烯而言，在油胞层中的含量从80DAB果实的25670.2μg/g FW增加到200DAB的45981.77μg/gFW，在汁胞中的含量则由15.00μg/g FW减少到2.90μg/g FW。在果实成熟过程中，罗勒烯和芳樟醇等芳香物质的含量也发生了显著的变化。其中，油胞层中的芳樟醇含量由701.75μg/g FW下降到448.07μg/g FW。 (4)结合芳香物质和转录组结果，并利用体外重组蛋白分析技术，鉴别出了参与果实芳香物质合成TPS基因家族成员。参与萜类芳香物质合成的MEP和MVA途径基因在油胞层中的表达量高于白皮层、囊衣和汁胞组织，这与油胞层具有显著高含量的萜类芳香物质结果吻合。萜类合成酶TPS是催化萜类芳香物质生物合成途径的末端酶，利用基因组序列鉴别出63个TPS基因家族成员，利用进化树分析筛选出35个可能功能的TPS基因，其中29个基因在玉环柚果实中表达。通过TPS基因表达和芳香物质含量的相关性分析，进一步筛选出5个参与单萜物质合成的候选基因家族成员。开展基因克隆并采用体外原核表达技术，鉴别出了2个催化单萜类合成的成员。来源于TPS-b亚家族的Cg8g012040催化罗勒烯合成，来源于TPS-g亚家族的Cg2g040850则参与芳樟醇合成。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1绪论

1．1柑橘果实芳香物质的研究进展

1．1．1柑橘果实芳香物质的功能

1．1．2不同种类／品种柑橘果实的芳香物质研究

1．1．3柑橘果实成熟过程的芳香物质变化

1．2萜类芳香物质合成的MEP和MVA途径

1．3柑橘萜类合成酶研究

1．4研究目的与内容

1．4．1研究目的

1．4．2研究内容

2材料与方法

2．1材料与处理

2．2分析方法

2．2．1果实色差的测定

2．2．2果实芳香物质检测

2．2．3果实不同部位RNA的提取与转录组测序

2．2．4TPS基因鉴别及系统进化树分析

2．2．5TPS基因的克隆

2．2．6原核表达

2．2．7数据分析

3玉环柚果实成熟过程中不同部位的芳香物质变化

3．1果实成熟过程中的色泽及重量变化

3．2玉环柚果实不同部位的芳香物质鉴别

3．3果实成熟过程不同部位的芳香物质变化

3．3．1芳香物质总含量的变化

3．3．2不同种类芳香物质含量的变化

3．3．3主要芳香物质组分的含量变化

3．4果实成熟阶段不同部位芳香物质的PCA分析

3．5讨论

4 TPS基因家族的鉴定及表达分析

4．1柚TPS基因家族成员鉴别

4．2柚TPS基因在染色体上的分布

4．3柚TPS基因结构分析

4．4柚TPS进化树分析

4．5玉环柚果实成熟过程中TPS基因表达分析

4．6筛选萜类芳香物质合成相关的TPS候选基因

4．7 TPS体外功能验证

4．8讨论

5 MEP与MVA途径的基因表达分析

5．1玉环柚果实MEP和MVA途径基因的鉴别

5．2玉环柚MEP途径以及MVA途径基因表达分析

5．3讨论

6小结与展望

附录

参考文献

作者的简历及在学期间所取得的科研成果