细菌性甘薯茎腐病菌Dickeya dadantii的检测

摘要

Dickeya dadantii引起的甘薯茎腐病是甘薯的一种毁灭性细菌病害，在国内外均有发生。中国是最大的甘薯生产国，甘薯茎腐病严重损害甘薯产业的健康发展。甘薯茎腐病病原菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，但目前国内外尚无针对D.dadantii的检测方法。本研究基于Dickeya属细菌全基因组序列，设计D.dadantii特异引物，建立特异灵敏的检测甘薯茎腐病菌的方法。 本研究通过基因组系统发育分析和基因组相似度比较确定了Dickyea属内各种细菌的分类地位，用基于细菌全基因组序列高通量设计引物的程序流程(FindDifferential Primers Pipeline)和泛基因组学分析发现种特有标志基因两种方法设计D.dadantii特异引物，PCR检测筛选出1对D.dadantii诊断引物Dad1-F(5'-CATATCAACCAGACCAGCCGTT)和Dad1-R（5'-CGGCCTGCTTTTAAACAACGTATTA），用该引物对能且只能从D.dadantii菌株中扩增到167-bp目的片段。基于该特异引物对建立了常规PCR、实时荧光定量PCR和免疫捕捉PCR三种检测方法。常规PCR对DNA的检测限为50pg·μL-1，对接种土壤、甘薯茎和甘薯块根的检测限为2×105 CFU·g-1。实时荧光定量PCR对DNA的检测限为500fg·μL-1，对接种土壤、甘薯茎和甘薯块根的检测限为2×104 CFU·g-1，并建立了该引物对的qPCR扩增标准曲线y=-1.9271x+36.607，拟合系数为0.9883。免疫捕捉PCR对接种甘薯茎和甘薯块根检测限为2×107 CFU·g-1，对接种土壤的检测限为2×106 CFU·g-1。 本研究建立了特异灵敏的常规PCR、qPCR和免疫捕捉PCR方法检测D.dadantii特有标志基因，为鉴定检测甘薯茎腐病病原菌提供了有效方法，对于检验检疫病原菌、田间监测病原菌和防控甘薯茎腐病有重要意义。

目录

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致谢

摘要

第一章文献综述

1甘薯茎腐病和病原菌Dickeya dadantii

1．2甘薯茎腐病病原茵Dickeya dadantii

1．3防治措施

2细菌性软腐病病原菌的检测和鉴定技术

2．1传统检测方法

2．2免疫学检测方法

2．3基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术

2．4基于实时荧光定量PCR(qPCR)的检测技术

2．5基于环介导等温扩增法(LAMP)的检测技术

2．6重组酶聚合酶扩增技术(RPA)

3研究背景和目的

第二章甘薯茎腐病病原茵的检测

2材料与方法

2．1实验材料

2．2泛基因组学分析

2．3 Dickeya属细菌系统分类

2．4两种基于全基因组序列设计特异性引物的方法

2．5 D．dadantii接种土壤和甘薯

2．6常规PCR和qPCR检测方法

2．7免疫捕捉PCR检测方法

3结果

3．1 Dickeya属细菌的系统分类

3．2特异性引物设计及验证

3．3甘薯茎腐病菌的检测

4讨论

参考文献

附表

作者简介