辅助分子伴侣SlBAG蛋白在番茄抗病反应中的功能研究

摘要

灰葡萄胞菌（Botrytis cinerea），即灰霉菌，是一种腐生病原真菌，它的营养方式为死体营养型，能够侵染上百种单子叶及双子叶植物引起灰霉病，严重危害作物生产、蔬菜质量以及水果保鲜。为了进一步探究番茄对灰霉菌的抗病机制，我们在本实验中采用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)、基因过表达等技术，研究了一个辅助分子伴侣调节因子蛋白家族SlBAG在番茄对灰霉菌抗性反应中的功能以及可能的作用机制。 分子伴侣(molecular chaperones)可以在蛋白质折叠、蛋白质质量控制、多亚基蛋白复合体的组装以及蛋白质的运输等过程中发挥重要作用。BAG(Bcl-2-associatedathanogene)家族是一个进化上高度保守的辅助分子伴侣蛋白家族，在多种植物、哺乳动物以及酵母菌中均已经发现了其同系物的存在。BAG家族蛋白具有共同的保守结构域，可以调控热激蛋白的功能，也可以与一系列转录因子和信号蛋白等形成复合体从而在各种生理过程中发挥作用。人们在哺乳动物中关于BAG家族的研究开始较早并且已经非常的广泛和深入;在拟南芥和水稻中已经分别鉴定到7个和6个BAG家族成员，它们不仅能够在植物的生长发育过程中发挥调控作用，还具有调节植物对非生物胁迫以及对腐生真菌抗病性的功能;但是在番茄中，BAG家族蛋白在对生物或非生物胁迫以及生长发育等过程中发挥的作用还不是很清楚。 在本研究中，我们在番茄基因组数据库中搜索，利用生物信息学方法鉴定并克隆到10个番茄SlBAG分子伴侣家族成员。蛋白保守结构域分析表明，这10个番茄SlBAG蛋白均包含一个保守的BAG结构域，并且预测的番茄SlBAG蛋白亚细胞定位是细胞核、线粒体或叶绿体。 我们利用VIGS技术对10个番茄SlBAG基因分别进行沉默，并对沉默植株接种B.cinerea。结果发现，SlBAG5沉默后增强了植株对灰霉菌的抗性;通过瞬时过表达以及病毒介导的过表达技术，发现SlBAG5过表达后能够引发活性氧积累以及细胞死亡等现象;利用实时荧光定量检测我们发现，SlBAG5的沉默和过表达还会影响B.cinerea诱导的JA/ET途径相关响应基因（SlNR1、SlLapA1、SlMYC2和SlJAZ7）以及SA途径相关响应基因（SlPR1b、SlPRP2）的表达水平;通过Luminol化学发光法我们检测到，SlBAG5的沉默和过表达能够改变chitin介导的PTI反应，如ROS的产生以及PTI相关基因SlPTI5、SlLRR22、SlERKY28的表达水平等。除此之外，我们还利用酵母筛库的方法，筛选到可能与SlBAG5互作的8个蛋白，并通过双分子荧光互补实验、CO-IP等其他实验方法进一步验证它们之间的互作。

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致谢

摘要

第一章文献综述

1．1植物与B．cinerea的互作机制

1．1．1 B．cinerea的侵染机制

1．1．2植物PTI和ETI对B．cinerea的抗性研究

1．1．3 植物细胞坏死调节机制对B．cinerea的抗性研究

1．2分子伴侣调节因子BAG家族研究进展

1．2．1 BAG家族的发现

1．2．2植物BAG蛋白结构特征

1．2．3 BAG蛋白在植物抗病中的作用

1．2．4 BAG蛋白在植物生长发育中的作用

1．2．5 BAG蛋白在植物胁迫响应中的作用

1．3本研究的主要目的和主要内容

2．1．1植物材料

2．1．2植物材料的培养及处理

2．1．3生化试剂

2．1．4载体与菌株

2．2实验方法

2．2．2植物总RNA的提取与反转录

2．2．3基因的克隆鉴定

2．2．4荧光实时定量PCR表达分析

2．2．5 VIGS体系、依赖病毒的过表达番茄体系的构建

2．2．6本氏烟瞬时过表达体系的建立

2．2．7蛋白质免疫印迹分析(Western blot)

2．2．8灰霉菌的培养与接种

2．2．9 DAB染色检测活性氧产生情况

2．2．10台酚蓝染色检测细胞坏死情况

2．2．11亚细胞定位

2．2．12酵母筛库

2．2．13酵母双杂验证

2．2．14双分子荧光互补试验

2．2．15 Luciferase实验

2．2．16免疫共沉淀(Co-IP)试验

2．2．17化学发光法ROS测定

第三章番茄SlBAG5在番茄对B．cinerea抗性中的作用

3．1．2 SlBAG家族成员的系统进化树构建

3．1．3 SlBAG家族成员的序列分析

3．1．4 SlBAG家族成员的蛋白结构域分析

3．2 SlBAG家族基因的表达模式分析

3．2．1 SlBAG家族基因组织特异性表达分析

3．2．2 SlBAG家族基因在激素诱导下的表达模式分析

3．2．3 SlBAG家族基因在灰霉菌诱导下的表达模式分析

3．3 SlBAG家族成员的亚细胞定位

3．4 SlBAG家族基因的抗病功能研究

3．4．1沉默SlBAG5基因增强灰霉菌诱导的番茄抗病反应

3．4．2在本氏烟中瞬时过表达SlBAG5基因减弱灰霉菌诱导的抗性反应

3．4．3过表达SlBAG5基因减弱灰霉菌诱导的番茄抗病反应

3．4．4SlBAG5基因沉默或过表达改变了灰霉菌诱导的SA、JA/ET途径响应基因的表达

3．4．5SlBAG5基因沉默或过表达影响chitin介导的PTI反应

3．4．6 SlBAG5互作蛋白的筛选

4．1讨论

4．2展望

参考文献

附录