分裂源激活蛋白二激酶、钙调蛋白结合转录因子、NADPH氧化酶和腺苷同型半胱氨酸水解酶在番茄抗病抗逆反应中的功能研究

摘要

植物在整个生命过程中，不断遭受外界环境各种逆境的胁迫。为了应对这些胁迫，植物进化形成了一系列精细调控的防御机制，并受复杂的信号传导网络所调控。本研究中，我们分离鉴定了番茄4个与抗病信号途径相关的家族基因，并研究了这些基因家族成员在番茄抗病抗逆反应中的生物学意义。 分裂源激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联是植物中高度保守的信号传导元件，负责胞外信号向胞内的传递，并在植物抗病过程中起重要用。但是，番茄MEK家族基因(SlMEKs)在番茄对灰霉菌抗病过程中的作用并不清楚。为此，我们分离鉴定了5个与番茄SlMEK基因。研究发现，在灰霉病病菌（Botrytis cinerea）侵染或水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号分子处理后，这5个SlMEKs基因的诱导表达模式不尽相同。利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)的方法，分别逐个沉默SlMEK基因后，番茄抗病性测定表明，SlMEK2和SlMEK4沉默植株对灰霉菌更加感病，且SlMEK2和SlMEK4沉默植株在灰霉菌处理后，活性氧产生增加，同时SlPR1b、SlPRP2、SlLapA和SlPIN2等防卫基因的表达量显著下调。在本氏烟（Nicotianabenthamiana）中瞬时过表达SlMEK2和SlMKE4能够诱导植株叶片产生HR和活性氧，且能提高对灰霉病病菌的系统抗性，上调NbPR1、NbPR2、NbPR4和NbPR5等防卫基因的表达。上述结果证明，SlMEK2和SlMEK4在番茄对灰霉病的抗病反应中起重要的调控作用。 CAMTA/SRs是一类钙调蛋白结合转录因子，在钙离子信号传导途径中起重要的作用。已经报道番茄基因组中有7个SRs基因，但番茄SlSRs家族基因在植物抗病抗逆中的作用并不清楚。荧光实时定量PCR分析番茄接种灰霉病病菌和丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst) DC3000)后SlSRs家族基因的诱导表达模式不尽相同。通过病毒诱导基因沉默的方法将SlSRs家族基因分别沉默后，发现SlSR1和SlSR3L沉默植株均提高对灰霉病菌和Pst DC3000的抗性;而且SlSR1和SlSR3L沉默植株能够自发产生活性氧，在无病菌侵染时组成型表达SlPR1b、SlPRP2、SlRboh1等抗病相关基因。同时，干旱胁迫能诱导SlSR1L的表达，SlSR1L沉默植株对干旱更敏感，失水速率较对照更快，且根系较对照更细短，根的净重也较对照更轻。在SlSR1L沉默植株中干旱相关基因SGN-213276、SlAREB1、SlAREB2、SlDREB和SlSpUSP等的表达水平表达显著下降。酵母实验显示，SlSR1和SlSR3L具有转录激活活性。亚细胞定位分析结果显示，SlSR1和SlSR3L均定位于细胞核内。这些结果表明，番茄SlSRs家族基因在番茄抗病抗旱过程中具有不同的调控作用。 植物Rbohs是活性氧合成酶之一，并通过介导活性氧的产生参与植物抗病反应。但是，番茄SlRbohs在番茄抗病中的作用还不见报道。在番茄基因组数据库中，我们鉴定到8个SlRbohs成员，它们均有典型的NADPH氧化酶结构域、EFhand结构域和NAD结合结构域等Rbohs蛋白保守结构域。荧光实时定量PCR分析表明，SlRbohs基因在灰霉菌和Pst DC3000接种处理时，表达模式有所不同。利用病毒诱导基因沉默的方法，我们将8个SlRbohs基因分别沉默后，病害分析显示，SlRbohB沉默植株对灰霉菌更加感病，同时SlRbohB沉默植株能够降低灰霉菌诱导活性氧的产生，以及PR基因的表达。进一步研究发现，SlRbohB沉默植株能够抑制激发子flg22诱导产生的活性氧，以及flg22系统诱导SlPti5和SlGras2的表达。这些结果表明，SlRbohB可能参与了植物早期活性氧的产生，从而调控了番茄与灰霉菌之间的互作。进一步瞬时过表达实验表明，本氏烟叶片上过表达SlRbohB后，增强植株对灰霉菌的抗性，但并不诱导本氏烟叶片产生活性氧。此外，SlRbohB沉默植株对干旱更为敏感，失水率较对照要快，且干旱正调控基因SGN-213276表达量显著下调，干旱负调控因子SGN-214777表达量显著上调，但SlRbohB沉默植株的根系与对照没有明显差别。亚细胞定位实验显示，SlRbohB功能定位于细胞膜上。这些结果表明，SlRbohB在番茄抗灰霉菌和抗旱过程中起重要的正调控作用。 SAHH是真核生物甲基化代谢过程中一个主要的酶，它在植物生长发育和对逆境适应过程中起着重要的作用。但是，番茄中SlSAHHs基因功能还不见报道。番茄基因组中共有3个SlSAHHs家族成员，序列分析显示，3个SlSAHHs序列在氨基酸水平上同源性极高，同源性达到97％以上。荧光实时定量PCR结果显示，SlSAHHs基因在根、茎和果实中表达较多，而在花中表达最少。灰霉菌接种后，SlSAHH2和SlSAHH3表达量显著升高，而SlSAHH1不受灰霉菌诱导表达。Pst DC3000处理后，SlSAHH1的表达量上升，而SlSAHH2和SlSAHH3的表达量没有显著变化。此外，SlSAHH2的表达均能受水杨酸、茉莉酸和乙烯的诱导，SlSAHH3受茉莉酸和乙烯的诱导表达，而3种植物抗病相关激素均不能诱导SlSAHH1的表达。将SlSAHHs基因通过病毒诱导基因沉默的方法逐一沉默时，沉默植株生长与对照没有差异。但将3个基因同时沉默时，SlSAHHa沉默植株(3个基因同时沉默植株)生长表现出矮化、叶片卷缩和根系细短等症状。沉默效率结果表明，SlSAHH2和SlSAHH3基因功能冗余。进一步研究发现，SlSAHHa沉默植株强烈诱导水杨酸途径相关PR基因的表达，且自发诱导活性氧的产生。病害实验显示，SlSAHHa沉默植株强烈增强对Pst DC3000的抗性，但不影响对灰霉菌的抗性。干旱实验显示，SlSAHHa沉默植株增强对于旱的适应。这些结果表明，SlSAHHs家族基因在番茄抗Pst DC3000和抗旱过程中起着重要的作用。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 激发子诱导植物免疫反应(PTI)

1．2 效应子激发的植物免疫反应(ETI)

1．3 MAPK级联反应在植物免疫中的作用

1．3．1 MAPK级联反应在拟南芥抗病中作用

1．3．2 MAPK级联反应在番茄抗病中作用

1．4 钙离子在植物抗病中的作用

1．4．1 CaMs和CMLs在植物免疫中作用

1．4．2 CDPKs在植物免疫中作用

1．4．3 CAMTA／SR在植物抗逆中的作用

1．5 植物Rboh基因在植物中的作用

1．5．1植物Rboh蛋白结构特征

1．5．2 植物Rboh基因细胞生长和植物发育中的作用

1．5．3 植物Rboh基因在植物非生物胁迫中的作用

1．5．4 植物Rboh在植物抗病中的作用

1．6 植物SAHH基因在植物中的作用

1．6．1 蛋氨酸循环

1．6．2 植物SAHH在甲基化过程中的作用

1．6．3 植物SAHH基因在植物中的作用

1．7 本研究的主要目的和主要内容

第二章 材料与方法

2．1 材料与处理

2．2 基因cDNA的克隆

2．3 DNA序列的测定及比对分析

2．4 总RNA的提取

2．5 VIGS载体构建和农杆菌转化

2．6 VIGS体系的建立

2．7 GFP过表达载体的构建

2．8 本氏烟瞬时表达体系的建立

2．9 蛋白的提取

2．10 Western blotting

2．11 荧光实时定量PCR(Real-time PCR)

2．12 灰霉菌的培养及其接种

2．12．1 灰霉菌的培养

2．12．2 灰霉菌的接种实验

2．12．3 灰霉菌病斑大小的统计

2．12．4 灰霉菌菌量测定

2．13 Pseudomonas syringae pv．tomato接种处理

2．14 DAB染色检测活性氧的产生

2．15 台酚蓝染色

2．16 转录活性分析

2．17 亚细胞定位

2．18 干旱处理

2．18．1 失水率的检测

2．18．2 根生长情况的检测

2．18．3 抗旱基因表达

第三章 番茄SlMKK2和SlMKK4在番茄对灰霉病抗性中的作用

3．1 结果

3．1．1 番茄SlMKKs家族基因序列分析

3．1．2 番茄SlMKKs基因表达分析

3．1．3 SlMKK2和SlMKK4沉默植株对灰霉菌感病

3．1．4 沉默SlMKK2和SlMKK4基因减弱灰霉菌诱导的植物抗病反应

3．1．5 瞬时过表达SlMKK2和SlMKK4激活对灰霉菌抗病反应

3．2 讨论

第四章 番茄SlSRs家族基因在植物抗病抗逆中的作用

4．1 结果

4．1．1 番茄CAMTA／SR家族基因诱导表达

4．1．2 SlSR1和SlSR3L沉默植株增强对灰霉菌和Pst DC3000的抗性

4．1．3 SlSR1和SlSR3L沉默植株自发诱导植物免疫反应

4．1．4 SlSR1L沉默植株对干旱逆境敏感

4．1．5 SlSRs亚细胞定位

4．1．6 SlSRs蛋白具有转录激活活性

4．2 讨论

第五章 SlRbohB在番茄对灰霉菌抗病中的作用

5．1 结果

5．1．1 番茄SlRbohs家族基因分析

5．1．2 番茄SlRbohs基因在病原菌侵染时表达模式

5．1．3 SlRbohB沉默植株对灰霉菌更加感病

5．1．4 SlRbohB沉默植株减弱灰霉菌诱导产生的免疫反应

5．1．5 SlRbohB沉默植株减弱激发子flg22诱导产生的免疫反应

5．1．6 本氏烟中瞬时过表达SlRbohB增强植株对灰霉菌的抗性

5．1．7 SlRbohB沉默植株对干旱敏感

5．1．8 SlRbohB亚细胞定位

5．2 讨论

第六章 SlSAHHs家族基因在植物抗病中的作用

6．1 结果

6．1．1 番茄SlSAHHs基因序列分析

6．1．2 SlSAHHs基因在不同组织和处理后表达模式

6．1．3 SlSAHHs沉默植株生长异常且诱导植物免疫反应

6．1．4 SlSAHHa沉默植株增强植物抗病性

6．1．5 SlSAHHa沉默植株增强对干旱逆境的适应

6．2 讨论

第七章 全文总结和今后研究

参考文献

附录