‘阳光玫瑰’葡萄病毒病原鉴定与脱毒技术研究

摘要

‘阳光玫瑰’(Vlabruscana Bailey×V.viniferaL.Shine Muscat)是近年兴起的一种鲜食二倍体欧美杂交种葡萄。该品种是日本果树所经‘安云津21号’(Akitsu-21)ב白南’(Hakunan V.vinifera)杂交选育而来。该品种呈黄绿色，果皮薄而果肉硬脆，正常栽培管理下可溶性固形物能达20％，具有诸多优良性状。但‘阳光玫瑰’在我国各地栽培中普遍表现类似病毒病症状，包括叶片反卷、畸形、透明斑等等，对果实产量、质量造成严重影响。为此本研究展开了针对‘阳光玫瑰’病毒病原鉴定，并探究高效的检测方法;探究适合‘阳光玫瑰’的组织培养体系和脱毒技术。主要研究结果如下: 1.不同果园‘阳光玫瑰’树体调查发现类病毒病症状主要表现在叶片上，叶片表现不同类型的畸形，包括泡状皱缩、皱缩畸形、塔状畸形、叶缘反卷等。春季萌发后当年扦插苗、两年生幼树较多年生树容易表现症状，但是树势较旺的树体上一般至开花前均不表现症状，在挂果后至落叶前病树会大量表现病症。 2.应用RT-PCR检测及核苷酸序列测定技术进行病原鉴定选定的10个品种调查样品中含有葡萄灰比诺病毒(GVPV)、葡萄卷叶伴随3型病毒(GLRaV-3)、葡萄斑点病毒(GFkV)、沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄病毒E(GVE)这6种病毒。其中‘阳光玫瑰’含有GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE这5种病毒，且其检出率均高于平均检出率，5种病毒复合感染率达36.36％。 3.优化模板浓度、引物浓度、聚合酶浓度等参数，建立了葡萄皱木复合病相关病毒GRSPaV、GVB、GVE的多重RT-PCR检测体系，即包含TaqMix6 ul、模板cDNA1μl、GRSPaV对应特异性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl体系;以及引起葡萄叶片畸形的相关病毒GVPV、GLRaV-3、GFkV的多重RT-PCR检测体系，即包含TaqMix6 ul、模板cDNA1μl、GLRaV-3对应特异性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl体系。 4.‘阳光玫瑰’单芽茎段为外植体的组织培养快速繁殖体系建立。无菌环境下离体培养诱使定芽萌发成株，其中外植体最佳消毒处理为0.1％氯化汞处理12min，成活率为51.7％;最适茎段初代培养基激素水平为0.5mg/L6-BA+0.5 mg/LKT，萌发率为56.2％;最适继代培养基为MS+0.5 mg/L6-BA，增殖率为1.89;最适生根培养基为1/2MS+0.5 mg/LNAA。 5.‘阳光玫瑰’茎尖组织培养体系建立。采用茎尖组织诱导再生的方法，其中外植体最佳消毒方案为0.1％氯化汞处理8 min，0.1 mm大小的外植体成活率为64.4％;最适茎尖初代培养基为1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.5 mg/LKT+0.2 mg/LIBA。 6.‘阳光玫瑰’葡萄脱毒健康种苗创制。采用多种脱毒方法，包括茎尖组织培养、热处理脱毒、热处理结合茎尖组织培养、超低温处理结合茎尖组织培养。其中热处理结合茎尖组织培养优于其他方法，表现最佳，再生率为90％，GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE的脱毒率分别为100.0％、80.0％、95.0％、70.0％、45.0％。

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缩略词表

摘要

第一章文献综述

1课题提出

2 '阳光玫瑰'葡萄主要病毒病病原概述

2．1葡萄灰比诺病毒

2．2葡萄卷叶伴随3型病毒

2．3葡萄斑点病毒

2．4沙地葡萄茎痘相关病毒

2．5葡萄病毒A

2．6葡萄病毒B

2．7葡萄病毒E

3植物病毒检测方法

3．1生物学检测

3．2血清检测

3．3电子显微镜观察检测

3．4分子生物学检测

4植物脱毒方法

4．1茎尖组织培养脱毒法

4．2热处理结合茎尖组织培养脱毒法

4．3化学试剂结合茎尖组织培养脱毒

4．4超低温处理结合茎尖组织培养脱毒法

4．5其他脱毒方法

5葡萄组织培养

6本研究的内容和目的

第二章基于不同检测方法的‘阳光玫瑰’主要病原鉴定

1试验材料

2试验方法与设计

2．1类病毒病症状观察

2．2 RT-PCR检测与序列分析

2．3多重RT-PCR检测优化

2．4实时荧光定量(qRT-PCR)分析

2．5数据分析

3结果与分析

3．1 ‘阳光玫瑰’异常树体的观察结果

3．2 RT-PCR检测结果

3．3多重RT-PCR检测优化

3．4实时荧光定量检测结果与RT-PCR检测结果比较

4讨论与小结

第三章'阳光玫瑰'离体快繁体系的建立

2．2试验方法

2．3数据统计分析方法

3结果与分析

3．1外植体消毒方案的选择

3．2初代培养基的选择

3．3继代培养基的选择

3．4生根培养基的选择

4讨论与小结

第四章'阳光玫瑰'脱毒技术的研究

1试验材料

2试验设计与方法

2．1试验技术路线

2．2试验方法

2．3数据统计分析方法

3结果与分析

3．1茎尖组织培养体系优化

3．2不同脱毒方法比较

4讨论与小结

展望

参考文献

附录

作者简历