三磷酸肌醇对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用研究

摘要

目的：大电导钙激活钾通道（BKCa通道）在血管平滑肌细胞膜上分布广泛，它在调节血管平滑肌张力机制中起着重要作用，BKCa通道被激活后可引起细胞膜的超极化，通过抑制L型钙通道,降低胞内钙浓度而起负反馈作用，引起平滑肌舒张。IP3是一种重要的胞内第二信使物质，有研究表明在内脏平滑肌细胞和血管平滑肌细胞，IP3可以诱发胞内IP3敏感钙库释放钙，使局部钙浓度瞬时增加，激活与其相邻的细胞膜上的BKCa通道，从而超极化细胞膜，导致平滑肌舒张。生理浓度毫摩尔级ATP在胞内IP3为高浓度时,可能协助IP3, 增强其使胞内钙库释放钙(IP3诱发的钙释放,IICR)的作用。IP3发挥作用的具体机理还没有满意的解释。本实验应用膜片钳单通道电流记录技术，研究了IP3对猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道的调控机制，及ATP与IP3对BKCa通道的协同作用。方法：分离猪冠状动脉，剔除外膜，保留平滑肌层和内膜，纵行剖开后将其剪成2×5mm的组织块，放入酶液经过酶解后获得单个平滑肌细胞，分离细胞在24小时内使用。取急性酶分离的平滑肌细胞置于对称性高钾溶液（［K+］O:［K+］I =140:140mM）中，用膜片钳技术记录单通道电流，所得电流通过膜片钳放大器（CEZ-2300）放大，滤波（1KHz）后输入计算机，用pCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。在细胞贴附式膜片和内面向外式膜片上观察不同浓度的IP3对BKCa通道的影响以及IP3与ATP对BKCa通道的联合作用。结果：1．在对称性高钾溶液中，内面向外式膜片（inside-out）下，记录到的猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道电导值为229.5±8.1pS（n=20）,具有电压依赖性和钙敏感性，2mM的TEA能够在胞外完全阻断通道活动。改变电极液和浴液的钾离子梯度，记录到的单通道电流具有明显的钾离子选择性。2．在细胞贴附式膜片（cell-attached）下，胞外IP3（10－60μM）对BKCa通道无明显影响。3.在内面向外式膜片下, 随着胞内IP3（10－60μM）浓度的增加，BKCa通道开放概率也相应增加，呈现浓度依赖性，主要是增加通道开放时间，明显缩短通道关闭时间。在已经加入IP3的膜片上继续加入ATP（2mM），可使通道开放概率明显增加，且呈多水平开放。4.在浴液钙离子浓度接近0 mM ([EGTA]=1mM, [Ca2+]=0mM)时，IP3对BKCa通道仍有激活作用，钙离子对IP3激活BKCa通道的作用没有影响。5.IP3对通道的电流幅度值及电导值无明显影响。结论：以上结果提示胞内IP3对猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道具有直接激活作用，这种作用与钙离子的浓度变化无明显关系，ATP可以增强胞内IP3对猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道的激活作用，使通道呈多水平开放，提示IP3和ATP联合作用可以增加通道的激活。IP3对BKCa通道的激活主要是缩短关闭时间。